【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物酶工程，具体地说，是一种糖基转移酶ugt91c1突变体及其应用。
技术介绍
1、近年来，全世界范围内龋齿、肥胖症、糖尿病、高血压、心血管疾病的患病风险不断增加，因此，消费者对低热量或无热量甜味剂的需求不断增加。从甜叶菊中提取得到的甜菊糖苷因其高甜度(是蔗糖的50-450倍)、无热量、安全，被认为是目前最具吸引力的甜味剂。此外，甜菊糖苷还被发现具有重要的药理活性，如降糖、降压、利尿、抗炎、抗肿瘤和免疫调节作用。如今已从甜叶菊中发现六十余种甜菊糖苷，其中甜菊糖(占叶子干重的5-10％)和莱鲍迪苷a(reb a，占叶子干重的2-4％)是含量最丰富的两种成分，也是目前市面上商用的甜菊糖苷类添加剂的主要成分。但甜菊糖和莱鲍迪苷a均存在较为明显的后苦味，相比之下，莱鲍迪苷d(reb d)具有更好的口感特性，是甜菊糖苷类甜味剂开发的新方向，甜菊糖苷相关的结构物质的毒性研究也证实了reb d食用安全，可用于食品药品等领域。2017年，美国食品药品监督管理局fda也认证reb d为“gras(generally recognized as safe，总体认为是安全的)”的级别。因此reb d是比reb a更优质的潜在天然甜味剂。
2、随着对甜味剂口感要求的提高，对reb d等高端产品的需求越来越大。然而，在甜叶菊植物中，reb d含量极低，仅约占干叶重的0.5％，分离提取成本较高，无法满足市场需求。糖基转移酶ugt91c1在尿苷二磷酸葡萄糖(udpg)存在条件下能够催化reb a生成reb d，但其野生型酶的酶活较低
技术实现思路
1、为解决现有技术中的上述问题，本专利技术通过对糖基转移酶ugt91c1进行结构改造，成功获得了具有高酶活的突变体，并将最优的突变体与蔗糖合酶sus联用，建立了udpg循环再生体系，避免了昂贵的udpg的额外添加，从而为reb d的生产提供了一种新的方法。
2、因此，本专利技术的第一个方面，提供了一种糖基转移酶ugt91c1突变体，所述突变体为：
3、(a)氨基酸序列如seq id no.3所示的蛋白质；或者
4、(b)在如seq id no:3所示的氨基酸序列中经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸序列、并且具有催化莱鲍迪苷a为莱鲍迪苷d的酶活性的由(a)衍生的蛋白质。
5、本专利技术的第二个方面，提供了一种编码所述的糖基转移酶ugt91c1突变体的基因序列。
6、本专利技术的第三个方面，提供了所述的糖基转移酶ugt91c1突变体的制备方法，包括以下步骤：
7、s1：根据登录号：xp_015629141.1从genbank中获得糖基转移酶ugt91c1的氨基酸序列，并按照毕赤酵母的密码子偏好性对序列进行优化，得到密码子优化的ugt91c1基因序列；
8、s2：进行全基因合成并连接至载体ppicza的多克隆酶切位点，得到重组质粒ppicza-ugt91c1；
9、s3：以重组质粒ppicza-ugt91c1为模板进行全质粒pcr，依次进行四轮定点突变，构建对应的携带突变体的重组质粒；
10、s4：经鉴定为正确的重组质粒转化至宿主菌中，获得转化子；
11、s5：对获得的转化子进行发酵，得到糖基转移酶ugt91c1突变体；
12、其中，步骤s3中四轮定点突变的引物对序列如下：
13、l150h-f：atgttgcatggttctgctcatatgattgcttctatt；(seq id no.4)
14、l150h-r：agcagaaccatgcaacatcatagcacatggaactttatg；(seq id no.5)
15、a205d-f：tctttggatgaaagattttctttgactttgtctagatcttct；(seq id no.6)
16、a205d-r：aaatctttcatccaaagacataccagaagaacctttag；(seq id no.7)
17、v284d-f：ctgaaggatcattgggtgttgaaaaagttcatgaa；(seq id no.8)
18、v284d-r：acccaatggatcttcagaacccaaagcaacataaacaac；(seq id no.9)
19、g380a-f：ccaatttttgctgatcaaggtccaaatgctagattg；(seq id no.10)
20、g380a-r：ttgatcagcaaaaattggcaacataatcaatggatg。(seq id no.11)
21、根据本专利技术的优选实施例，步骤s1中所述的密码子优化的ugt91c1基因的序列如seq id no.1所示。
22、本专利技术的第四个方面，提供了一种重组表达载体，所述重组表达载体克隆有编码所述的糖基转移酶ugt91c1突变体的基因序列。
23、本专利技术的第五个方面，提供了一种毕赤酵母重组菌株，所述重组菌株克隆有所述的重组表达载体。
24、根据本专利技术的优选实施例，所述重组菌株是将所述的重组表达载体转化至毕赤酵母x33而得到。
25、本专利技术的第六个方面，提供了一种莱鲍迪苷d的合成方法，所述方法是利用所述的糖基转移酶ugt91c1突变体与蔗糖合酶sus联用，以莱鲍迪苷a为底物进行催化反应而得到莱鲍迪苷d。
26、根据本专利技术的优选实施例，编码所述蔗糖合酶sus的基因的序列如seq id no.2所示。
27、根据本专利技术的优选实施例，所述催化反应的反应温度为40℃，以10ml计的反应体系包括：
28、100mm磷酸钾缓冲液(ph 8.0，含100mm nacl)、300mm蔗糖、0.8mm udp、10g/lreba、10mg蔗糖合酶sus、50mg糖基转移酶ugt91c1。
29、本专利技术的第七个方面，提供了一种所述的糖基转移酶ugt91c1突变体的应用，用于催化莱鲍迪苷a合成莱鲍迪苷d。
30、本专利技术具有以下有益效果：
31、1、本专利技术通过定点突变显著提高了糖基转移酶ugt91c1的酶活，与野生型糖基转移酶ugt91c1相比，最优突变体酶活提高达4.42倍，因而能够显著降低酶的使用量。
32、2、本专利技术将糖基转移酶ugt91c1突变体与蔗糖合酶sus分别于毕赤酵母中进行异源表达，不需纯化，利用粗酶液构建“udp-udpg”的循环再生体系，避免了额外添加udpg作为糖基供体，因而可以显著降低成本。
33、3、本专利技术通过对催化反应条件的优化，进一步提高了莱鲍迪苷a(reb a)的转化率和莱鲍迪苷d(reb d)的产量，具有很好的应用前景。
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1.一种糖基转移酶UGT91C1突变体，其特征在于，所述突变体为：
2.编码权利要求1所述的糖基转移酶UGT91C1突变体的基因序列。
3.根据权利要求1所述的糖基转移酶UGT91C1突变体的制备方法，其特征在于包括以下步骤：
4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，步骤S1中所述的密码子优化的UGT91C1基因的序列如SEQ ID NO.1所示。
5.一种重组表达载体，其特征在于，所述重组表达载体克隆有编码权利要求1所述的糖基转移酶UGT91C1突变体的基因序列。
6.一种毕赤酵母重组菌株，其特征在于，所述重组菌株克隆有权利要求5所述的重组表达载体。
7.根据权利要求6所述的毕赤酵母重组菌株，其特征在于，所述重组菌株是将权利要求5所述的重组表达载体转化至毕赤酵母X33而得到。
8.一种莱鲍迪苷D的合成方法，其特征在于，所述方法是利用权利要求1所述糖基转移酶UGT91C1突变体与蔗糖合酶SUS联用，以莱鲍迪苷A为底物进行催化反应而得到莱鲍迪苷D。
9.根据权利要求8所述的合成方法
10.根据权利要求8所述的合成方法，其特征在于，所述催化反应的反应温度为40℃，以10mL计的反应体系包括：
11.权利要求1所述的糖基转移酶UGT91C1突变体的应用，其特征在于，用于催化莱鲍迪苷A合成莱鲍迪苷D。
...【技术特征摘要】
1.一种糖基转移酶ugt91c1突变体，其特征在于，所述突变体为：
2.编码权利要求1所述的糖基转移酶ugt91c1突变体的基因序列。
3.根据权利要求1所述的糖基转移酶ugt91c1突变体的制备方法，其特征在于包括以下步骤：
4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，步骤s1中所述的密码子优化的ugt91c1基因的序列如seq id no.1所示。
5.一种重组表达载体，其特征在于，所述重组表达载体克隆有编码权利要求1所述的糖基转移酶ugt91c1突变体的基因序列。
6.一种毕赤酵母重组菌株，其特征在于，所述重组菌株克隆有权利要求5所述的重组表达载体。
7.根据权利要求6所...
【专利技术属性】
技术研发人员：张明义，窦培冲，平千，柳清霞，陈煜乾，仝金皖，李慧婷，朱梦丹，张莲莲，
申请(专利权)人：铭诚惠众江苏药物研究有限公司，
类型：发明
国别省市：
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