【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生物，特别涉及一种基于crispr/rfxcas13d系统的特异性敲低植物circrna的方法。
技术介绍
1、环状rna(circrna)是近年来加入非编码rna家族的新成员，具有共价闭合的环状结构，区别于大多数线性rna。研究表明，circrna结构稳定、种类丰富、序列保守、在细胞和组织中特异性表达，并具备很多潜在功能，在调控基因表达和各种生物学功能方面发挥着重要作用，可以作为生物传感器、调节剂和潜在治疗工具，为未来作物抗病育种提供新的策略和工具。
2、然而，由于circrna与其同源线性mrna除了反向剪接位点(bsj)外，共享重叠序列，这一特征使得很难区分circrna及其同源mrna的功能，因此，敲低circrna的水平而不影响其亲本基因的表达仍然是一个挑战。目前，通过rna干扰(sirna/shrna)敲低circrna，是人类和动物中常用的方法。但是，在植物circrna研究中，目前只能通过crispr-cas9系统直接敲除形成环状rna的外显子，或通过敲除侧翼序列中的反向互补序列来抑制circrna的生物发生，达到敲除circrna的目的，然而，由于circrna的序列与其亲本基因的序列几乎完全一致，因此，crispr-cas9系统对于只敲除circrna而不影响其亲本基因的表达通常达不到一个很好的结果。因此，目前植物circrna的特异性敲低还未有可行的办法。
3、rfxcas13d酶的平均长度为930个氨基酸，比其他cas13酶小20％，比cas9更是小33％。在向导rn
4、因此，目前亟待克服现有技术中的困难，实现circrna编辑技术在植物体内的突破，构建能够适用于植物circrna敲低的crispr/rfxcas13d载体，靶向植物circrna bsj位点上的序列，有效且特异地区分环状rna和mrnas，对circrna进行特异性的敲低。这将极大的加快植物circrna的功能研究，进而实现植物育种中circrna功能增益突变体和新种质的开发。
技术实现思路
1、本专利技术的目的在于提供一种基于crispr/rfxcas13d系统的特异性敲低植物circrna的方法，用于解决现有技术中未能在植物体内实现对目的circrna特异性编辑的问题，极大的加快植物circrna的功能研究，进而实现植物育种中circrna功能增益突变体和新种质的开发。
2、本专利技术提供了一种基于crispr/rfxcas13d系统的特异性敲低植物circrna的方法，包括以下步骤：
3、s1、设计并合成植物密码子偏好性的编码rfxcas13d的目的基因序列，构建pcambia1300-rfxcas13d重组载体；
4、s2、合成atu6-crrna基因片段，所述atu6-crrna基因片段包含两个bsai酶切位点，构建pentr4:grna4-atu6-crrna重组载体；
5、s3、合成构建特异性靶向植物circrna bsj位点的pcambia1300-rfxcas13d-bsj-crrna载体；
6、s4、将构建好的pcambia1300-rfxcas13d-bsj-crrna表达载体介导转入植物愈伤组织，通过组织培养获得特异性敲低植物circrna的转基因植株。
7、优选的，步骤s1中，所述pcambia1300-rfxcas13d重组载体包括camv 35s启动子，潮霉素基因，camv poly(a)信号终止子，pvs1 repa，pvs1复制起点，水稻泛素化启动子，sv40 nls-rfxcas13d-sv40 nls和nos终止子。
8、优选的，步骤s1包括以下步骤：通过植物密码子偏好性优化编码rfxcas13d的目的基因序列并合成，直接克隆到线性化的puc57载体上，命名为puc57：rfxcas13d。以crispr/spcas9载体为基础，利用bamhi和ncoi对质粒puc57：rfxcas13d和crispr/spcas9载体进行双酶切，分别回收3003bp rfxcas13d基因片段和约12.6kb的crispr/spcas9载体骨架，利用t4 dna连接酶将3003bp rfxcas13d片段连接至crispr/spcas9载体骨架，质粒命名为pcambia1300-rfxcas13d，质粒测序后保存，验证成功后转化大肠杆菌保存。
9、优选的，sv40 nls-rfxcas13d-sv40 nls基因的碱基序列为seq idno.1。
10、seq id no.1(sv40 nls-rfxcas13d-sv40 nls)
11、atgtctccgaaaaaaaaaaggaaggtcgaggcgagcattgagaaaaagaagagctttgctaaaggtatgggggttaagagtacattggtgtccggttccaaagtgtatatgactacatttgcggaaggcagcgacgcaaggctggagaaaatagttgaaggcgattcaataagatcggtgaatgaaggagaagccttctccgctgaaatggccgacaaaaatgccggttataagattggtaacgctaagttctcgcacccaaagggttatgcagtcgtggcgaacaatccactgtacacaggtcctgtgcagcaggatatgcttggtttgaaggaaacgttggaaaagcggtacttcggtgagtccgctgacggcaatgataatatatgtattcaggtgatacacaacatcctcgatatagaaaaaatcctcgctgagtacattacaaatgccgcctacgcggtcaataacatatccggtttggacaaagacatcataggatttggaaaattctctacagtgtacacgtacgatgaatttaaagacccggagcatcacagagcagctttcaacaacaatgataagctcataaatgcaataaaagcgcaatatgatgaatttgacaactttcttgataacccgaggctgggctattttggtcaggctttcttcagcaaagaagggcgcaactatattataaattacggcaatgagtgctatgatattttggcattgttgtccggactgcggcattgggttgttcataata本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种基于CRISPR/RfxCas13d系统的特异性敲低植物circRNA的方法，其特征在于，包括以下步骤：
2.如权利要求1所述的一种基于CRISPR/RfxCas13d系统的特异性敲低植物circRNA的方法，其特征在于，步骤S1中，所述pCAMBIA1300-RfxCas13d重组载体包括CaMV 35S启动子，潮霉素基因，CaMV poly(A)信号终止子，pVS1 RepA，pVS1复制起点，水稻泛素化启动子，SV40 NLS-RfxCas13d-SV40 NLS和NOS终止子。
3.如权利要求2所述的一种基于CRISPR/RfxCas13d系统的特异性敲低植物circRNA的方法，其特征在于，步骤S1包括以下步骤：通过植物密码子偏好性优化编码RfxCas13d的目的基因序列并合成，直接克隆到线性化的pUC57载体上，命名为pUC57：RfxCas13d。以CRISPR/spCas9载体为基础，利用BamHI和NcoI对质粒pUC57：RfxCas13d和CRISPR/spCas9载体进行双酶切，分别回收3003bp RfxCas13d基因片
4.如权利要求2所述的一种基于CRISPR/RfxCas13d系统的特异性敲低植物circRNA的方法，其特征在于，SV40 NLS-RfxCas13d-SV40 NLS基因的碱基序列为SEQ ID No.1。
5.如权利要求2所述的一种基于CRISPR/RfxCas13d系统的特异性敲低植物circRNA的方法，其特征在于，RfxCas13d编码的氨基酸序列为SEQ IDNo.2。
6.如权利要求1所述的一种基于CRISPR/RfxCas13d系统的特异性敲低植物circRNA的方法，其特征在于，步骤S2中，pENTR4:gRNA4-AtU6-crRNA重组载体包括AtU6启动子，crRNA重复前导序列，含有两个BsaI酶切位点的spacer核苷酸序列。
7.如权利要求6所述的一种基于CRISPR/RfxCas13d系统的特异性敲低植物circRNA的方法，其特征在于，AtU6-crRNA基因片段的碱基序列为SEQ ID No.3。
8.如权利要求6所述的一种基于CRISPR/RfxCas13d系统的特异性敲低植物circRNA的方法，其特征在于，步骤S2包括：利用HindIII线性化pENTR4:gRNA4载体，回收线性化载体骨架，人工合成包含两个BsaI酶切位点的AtU6-crRNA基因片段，通过HindIII酶切位点直接合成到pENTR4:gRNA4载体上，得到pENTR4:gRNA4-AtU6-crRNA载体，质粒测序后保存，验证成功后转化大肠杆菌保存。
9.如权利要求1所述的一种基于CRISPR/RfxCas13d系统的特异性敲低植物circRNA的方法，其特征在于，步骤S3包括：针对circRNA的BSJ位点设计gRNAs靶向序列，合成RfxCas13d-BSJ-gRNA靶点序列引物，通过引物退火的方式连接至BsaI线性化的pENTR4:gRNA4-AtU6-crRNA载体上；将上步构建好的pENTR4:gRNA4-AtU6-BSJ-crRNA载体为模板，设计带HindIII和SbfI酶切位点的引物，扩增出带HindIII和SbfI酶切位点的AtU6-BSJ-crRNA片段，用HindIII和SbfI对pCAMBIA1300-RfxCas13d重组载体进行双酶切，最后通过同源重组方式得到pCAMBIA1300-RfxCas13d-BSJ-crRNA载体。
10.如权利要求1所述的一种基于CRISPR/RfxCas13d系统的特异性敲低植物circRNA的方法，其特征在于，所述植物包括水稻、番茄、拟南芥。
...【技术特征摘要】
1.一种基于crispr/rfxcas13d系统的特异性敲低植物circrna的方法，其特征在于，包括以下步骤：
2.如权利要求1所述的一种基于crispr/rfxcas13d系统的特异性敲低植物circrna的方法，其特征在于，步骤s1中，所述pcambia1300-rfxcas13d重组载体包括camv 35s启动子，潮霉素基因，camv poly(a)信号终止子，pvs1 repa，pvs1复制起点，水稻泛素化启动子，sv40 nls-rfxcas13d-sv40 nls和nos终止子。
3.如权利要求2所述的一种基于crispr/rfxcas13d系统的特异性敲低植物circrna的方法，其特征在于，步骤s1包括以下步骤：通过植物密码子偏好性优化编码rfxcas13d的目的基因序列并合成，直接克隆到线性化的puc57载体上，命名为puc57：rfxcas13d。以crispr/spcas9载体为基础，利用bamhi和ncoi对质粒puc57：rfxcas13d和crispr/spcas9载体进行双酶切，分别回收3003bp rfxcas13d基因片段和约12.6kb的crispr/spcas9载体骨架，利用t4 dna连接酶将3003bp rfxcas13d片段连接至crispr/spcas9载体骨架，质粒命名为pcambia1300-rfxcas13d，质粒测序后保存，验证成功后转化大肠杆菌保存。
4.如权利要求2所述的一种基于crispr/rfxcas13d系统的特异性敲低植物circrna的方法，其特征在于，sv40 nls-rfxcas13d-sv40 nls基因的碱基序列为seq id no.1。
5.如权利要求2所述的一种基于crispr/rfxcas13d系统的特异性敲低植物circrna的方法，其特征在于，rfxcas13d编码的氨基酸序列为seq idno.2。
6.如权利要求1所述的一种基于crispr/rfxcas13d系统的特...
【专利技术属性】
技术研发人员：朱勃，刘晓慧，王沛鸿，王赛，廖维雪，欧阳明艳，林思思，林戎鹏，
申请(专利权)人：上海交通大学，
类型：发明
国别省市：
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。