【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生物，尤其涉及一种海参花降压肽及其制备工艺和应用。
技术介绍
1、血管紧张素转化酶(ace)抑制肽是经过蛋白水解后形成的小分子多肽，它具有显著的降血压作用，更有效的是它与其它普通降压药物比较发现，降压肽无毒副作用，并且对正常的血压无影响。ace在血压调节中起重要作用，经碳端两个氨基酸(his-leu)的切除，能够把原本无活性的血管紧张素ⅰ转变为具有活性的血管紧张素ⅱ，引起血管收缩，使血压上升；ace还会使具有血管舒张功能的舒缓激肤失活，同样又引起血压上升的情形，降压肽能够阻断ace引起的两种生化反应过程，起到降血压的作用。
2、海参具有较高的营养价值和经济价值，海参大部分采用干制的方式进行出售，海参在干制前一般会将其内脏剔除。在繁殖期捕捞来的海参母体，其腹腔内的存在籽卵(海参花)，以往加工时，海参花通常会连同其它内脏一起被丢弃。
3、然而，海参花中也含有丰富的营养物质，甚至高于海参皮，海参花还被赐予海参花美名。在人们意识到海参花的价值后，当下的做法通常也是将取出的海参花进行干制处理，再将得到的海参花干进行单独售卖。但是，海参花干制过程中容易破坏小分子物质，导致其营养物质大量流失，而且海参花干的保质期较短。因此对海参花进行深加工以提高其利用价值具有重大意义，目前，也没有以海参花为原料制备降压肽的相关研究。
技术实现思路
1、本专利技术的目的在于提供一种海参花降压肽及其制备工艺和应用，其以海参花为原料，获得海参花降压肽的氨基酸序列，且制备的海参花降
2、为达到上述目的，本专利技术公开了一种海参花降压肽，其氨基酸序列为：ddqyhif。
3、优选地，其ic50为0.333±0.025mmol/l。
4、上述海参花降压肽的制备工艺，其包括以下步骤：
5、s1.制备小分子肽冻干粉
6、选取海参花作为原料，利用碱性蛋白酶酶解海参花，酶解结束后灭酶和离心处理，得到酶解液；酶解液经粗滤和超滤处理后，收集得到小于3kda分子量的小分子多肽组分，冻干后即得小分子肽冻干粉；
7、s2.制备低聚肽冻干粉
8、利用中压蛋白纯化仪对小分子肽冻干粉进行固定化酶凝胶靶向亲和吸附，之后进行洗脱和脱盐处理，得到靶向亲和洗脱液；对靶向亲和洗脱液进行pr-hplc分析，并对靶向亲和洗脱液的各组分进行分离，真空冷冻干燥处理后，对靶向亲和洗脱液的各组分进行ace抑制率测定，ace抑制率最高的组分即为低聚肽冻干粉；
9、s3.序列鉴定
10、采用lc-ms/ms对低聚肽冻干粉进行质谱测定，质谱测定的结果采用质谱分析软件分析，获得多条不重复多肽序列；
11、s4.虚拟筛选
12、通过软件将多肽序列与ace蛋白进行分子对接，筛选得到与ace蛋白结合能力强的多肽序列；
13、s5.多肽合成
14、将筛选得到的多肽序列进行固相合成，筛选活性高的多肽序列，即得到海参花降压肽。
15、优选地，步骤s1中，先将海参花与超纯水振荡均匀，底物浓度为3～5％，调节ph为8.0～10，然后在50～60℃温度下，加入碱性蛋白酶进行酶解，碱性蛋白酶的添加量为2000～3000u/g，酶解3～7h；酶解结束后，于95～100℃的水浴锅中进行钝化灭酶15～25min，自然冷却后，于4～6℃、4000～6000r/min条件下离心10～20min，取上清液，即得酶解液；酶解液采用200nm陶瓷膜进行粗滤，再采用相对分子质量为3kda的超滤膜进行超滤。
16、优选地，步骤s1中，海参花酶解时，底物浓度为3.5％，ph调整为9，酶解温度为65℃，碱性蛋白酶的添加量为3.5u/mg，酶解时间为5h。
17、优选地，步骤s2中，获取靶向亲和洗脱液的具体操作方法为：
18、s21：将溴化氰活化琼脂糖4b填料与其3倍体积的ph8.0的tris-hcl缓冲液进行混匀处理后轻柔振荡2h过滤；过滤液采用ph4.0的0.1m醋酸盐缓冲液和ph 8.0的0.1m tris-hcl缓冲液交替清洗并重复操作3～5次，得ace固定化凝胶填料；其中，醋酸盐缓冲液中含0.5m的nacl，tris-hcl缓冲液中含0.5m的nacl；
19、s22：将ace固定化凝胶填料悬浮于其3倍体积的硼酸盐缓冲液，装填入5ml中压层析柱中，即得固定化酶凝胶靶向亲和吸附柱；
20、s23：将固定化酶凝胶靶向亲和吸附柱安装在中压蛋白纯化仪，用摩尔浓度为0.1mol/l、ph8.0的硼酸盐缓冲液进行平衡过液，平衡流速0.6ml/min，紫外检测波长为220nm；
21、s24：将小分子肽配制成1mg/ml浓度作为上样液，进行靶向亲和吸附；
22、s25：以ph8.3的0.1mol/l硼酸盐缓冲液为洗脱流动相进行洗脱，洗脱流速0.6ml/min，收集洗脱峰组分并将多次洗脱峰组分合并，使用100da透析膜进行脱盐处理后即得靶向亲和洗脱液；其中，硼酸盐缓冲液中包含1mol/l的nacl。
23、优选地，步骤s2中，pr-hplc分析具体为：色谱条件：c18，检测器：dad二极管阵列检测器,流动相：a相：含0.1％ tfa的水，b相：含0.1％ tfa的乙腈，流动相梯度：5～30％b相，流速1ml/min，梯度时间30min，流速：0.5ml·min-1，检测波长：228nm。
24、优选地，步骤s3具体为：采用q-exactive质谱仪对低聚肽冻干粉进行分析，用c18除盐柱进行除盐，将样品经由配备在线纳喷离子源的lc-ms/ms分析上样3μl样品，柱流量控制在300nl/min，柱温为40℃，电喷雾电压2kv，质谱参数设置如下：质量/电荷(m/z)＝100～1500；一级ms分析的操作条件如下：分辨率＝70000；agc target＝3e6；最大it＝50ms；扫描电荷＝1～6；二级ms/ms的操作条件：分辨率＝17500；topn＝20；隔离窗口＝2m/z；agctarget＝1e5；最大it＝60ms；nce/stepped nce＝28kv，动态排除时间＝30s；质谱原始文件由peaks studio进行分析。
25、优选地，步骤s4具体为：以晶体结构为1o8a的ace作为受体，运用对接软件ucsfdock 6.9对ace分子加氢、加电荷和除水、质子化预处理，保留zn2+，剔除远离的cl-，进行能量最小化amber ff12sb处理，将步骤s3获得的多肽序列以discovery studio 2019client绘制小分子作为配体，最后确定ace的活性口袋，在口袋范围10，盒子边缘6的条件下虚拟筛选；将虚拟筛选的结果通过grid score得分进行排名，挑选出前20条分数较高的多肽序列。
26、另外，本专利技术还公开了上述海参花降压肽在制备辅助降血压药物中的应用。
27、本专利技术具本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种海参花降压肽，其特征在于，其氨基酸序列为：DDQYHIF。
2.如权利要求1所述的海参花降压肽，其特征在于：其IC50为0.333±0.025mmol/L。
3.如权利要求1所述的海参花降压肽的制备工艺，其特征在于，包括以下步骤：
4.如权利要求3所述的海参花降压肽的制备工艺，其特征在于：步骤S1中，先将海参花与超纯水振荡均匀，底物浓度为3～5％，调节pH为8.0～10，然后在50～60℃温度下，加入碱性蛋白酶进行酶解，碱性蛋白酶的添加量为2000～3000U/g，酶解3～7h；酶解结束后，于95～100℃的水浴锅中进行钝化灭酶15～25min，自然冷却后，于4～6℃、4000～6000r/min条件下离心10～20min，取上清液，即得酶解液；酶解液采用200nm陶瓷膜进行粗滤，再采用相对分子质量为3kDa的超滤膜进行超滤。
5.如权利要求4所述的海参花降压肽的制备工艺，其特征在于：步骤S1中，海参花酶解时，底物浓度为3.5％，pH调整为9，酶解温度为65℃，碱性蛋白酶的添加量为3.5U/mg，酶解时间为5h。
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