【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及病原微生物检测，具体为引物组合物、基于ont测序检测生殖感染病原的试剂盒及应用。
技术介绍
1、女性生殖道病原微生物感染是妇科中较常见的一种，该病复发率较高，且容易出现混合感染的情况，对患者生活质量产生不良影响。生殖道感染(rti)包括很多除最常见的霉菌，滴虫，衣原体，细菌病毒感染外，还包括淋病，梅毒，艾滋病等。当前rti及性传播疾病的流行已经成为突出的社会问题。who估计每年全球有3.43亿人感染可治愈的四种rti疾病：包括淋病，衣原体(ct)，梅毒和滴虫。根据世界卫生组织2018年的统计数据，全球每年约57万妇女被诊断为宫颈癌，其中有31万妇女死于宫颈癌。中国宫颈癌新发病例和死亡病例均约占全球的五分之一，每年新发病约13.15万例，在15-44岁女性中居第2位，每年死亡约5.3万例，约占全部女性恶性肿瘤死亡人数的18.4％。宫颈癌主要是通过性接触，hpv感染，母婴等方式传播。
2、宫颈癌是目前唯一病因明确、可以早期预防和治愈的恶行肿瘤，99.9％的宫颈癌与人乳头瘤病毒(human papilloma virus；hpv)感染相关，持续高危hpv感染是宫颈癌主要原因，且不同型别的hpv感染带来的风险不同。hpv16/18亚型是最常见的hpv致癌亚型，全世界约75％宫颈癌是由这2种hpv亚型引起，而这2种亚型导致的宫颈癌在中国妇女的宫颈癌中占85％。90％发生hpv感染的妇女可自然清除，少部分发生持续感染，进而进展为可检出的宫颈癌前病变，最终导致癌变。世界卫生组织建议30-49岁的女性每3-5年做一次细
3、目前临床上检测生殖感染的方法有培养技术，免疫技术，pcr技术。其中培养方法耗时较长，且培养阳性率较低，不利于及时诊断和精准用药。免疫技术需要有特异的抗血清；pcr技术由于实验步骤多，且很容易产生气溶胶污染，导致假阳性结果较多。
4、中国专利文献cn109457037a公开了一种生殖道病原体核酸检测试剂盒，采用荧光pcr探针法检测生殖的5种常见病原体，受限于荧光通道个数，检测物种受限，成本较高。
5、中国专利文献cn108660254a公开了生殖道病原体核酸检测引物、探针、试剂盒及检测方法，基于量子点(荧光标记探针)和pcr技术可同时对14种生殖道病原体和18种hpv基因分型的同时检测。
6、中国专利文献cn111020061a公开了基于高通量测序检测hpv的多重pcr引物组、试剂盒及其方法，基于第二代测序又称为高通量测序，该测序技术的出现结合多重pcr技术，实现了多样本多靶标的同时检测，但多重pcr扩增重数亦受限于引物设计和反应体系，扩增重数受到限制。二代宏基因组技术可针对所有病原进行检测，但该方法有易污染、解读困难等问题。另外二代测序时间周期较长，无法快速诊断，提供用药辅助。高通量测序多重pcr，存在样本之间交叉污染的可能，且操作复杂，在应对大量样本时存在困难。
7、纳米孔测序(oxfordnanoporetechnologies，简称ont)是新一代基于纳米孔的单分子实时电信号测序技术。它能够直接实时分析任意长度的dna或rna片段。通过实时监测核酸通过蛋白纳米孔时的电流变化来工作，解码这些电流信号以确定碱基序列。该测序技术能边测序边分析，大大缩短了测序时间。但目前常用的16s、its等通用条形码鉴定序列，大部分能准确鉴定到属，无法精准鉴定到种，甚至亚种。
8、因此有必要基于ont测序平台，针对更多病原微生物设计一种用于检测生殖感染病原的引物组合物，用于快速准确的获得更多病原微生物以及hpv分型精准鉴定结果，提升生殖感染病原检测的效率并扩大临床应用范围。
技术实现思路
1、本专利技术提供了引物组合物、基于ont测序检测生殖感染病原的试剂盒及应用，用于快速准确的获得更多病原微生物以及hpv分型精准鉴定结果，提升生殖感染病原检测的效率并扩大临床应用范围。
2、有鉴于此，本专利技术的方案为：
3、本专利技术的第一个方面，提出一种引物组合物，包括用于检测病原微生物的第一引物组，和用于hpv分型的第二引物组；第一引物组包括如seq id no：1-84、seq id no：195-196所示的核苷酸序列，第二引物组包括如seq id no：85-194所示的核苷酸序列。
4、本专利技术的第二个方面，提出第一方面所述引物组合物在制备生殖感染病原检测试剂盒中的应用。
5、本专利技术的第三个方面，提出一种生殖感染病原检测试剂盒，用于ont测序平台测序，包括多重扩增引物组，和若干用于区分不同样本的barcode序列，所述多重扩增引物组包括第一个方面所述的引物组合物；所述引物组合物及barcode序列的每一条序列分别连接有公共序列。
6、进一步地，所述barcode序列为96个，核苷酸如seq id no：203-298所示。
7、进一步地，所述公共序列的核苷酸序列如seq id no：299所示，连接至所述引物组合物的5’端和barcode序列的3’端。
8、进一步地，所述生殖感染病原检测试剂盒还包括外质控引物和人源特异性引物。
9、优选地，生殖感染病原检测试剂盒中，所述外质控引物核苷酸序列如seq id no：197-200所示；
10、优选地，生殖感染病原检测试剂盒中，所述人源特异性引物核苷酸序列如seq idno：201-202所示。
11、进一步地，生殖感染病原检测试剂盒中，所述多重扩增引物组浓度为5-100nm。
12、进一步地，所述生殖感染病原检测试剂盒还包括pcr反应液和用于构建测序文库的末端修复液、接头连接酶、缓冲液。
13、本专利技术的第四个方面，提出一种非诊断为目的检测生殖感染病原的方法，步骤包括：
14、a)以样本核酸为模板，使用多重扩增引物组进行pcr扩增；
15、b)将pcr扩增产物与barcode序列进行pcr连接，根据样本的数量选择不同的barcode序列；
16、c)混合连接barcode标签的pcr产物，进行末端修复、接头连接和纯化，构建文库并上机测序，根据测序结果比对病原数据库并分析检测结果；
17、其中：步骤a)中多重扩增引物组为第三个方面所述试剂盒中的多重扩增引物组；步骤b)中barcode序列为第三个方面所述试剂盒中的barcode序列。
18、上述检测方法中，非诊断为目的的检测包括无法追溯至人的样本的检测鉴定，生殖感染实验室筛查鉴定，检测结果仅代表样本自身结果，即生殖感染病原客观的存在或不存在。
19、与现有技术相比，本专利技术具备以下有益效果：
20、1.本专利技术提供的引物组合物，基于36种病原微生物基因序列设计，互相之间无交叉反应，引物序列干扰竞争小，可用于15种病原微生物以及21种hpv分型精准鉴本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.引物组合物，其特征在于，包括用于检测病原微生物的第一引物组，和用于HPV分型的第二引物组；第一引物组包括如SEQ ID NO：1-84、SEQ ID NO：195-196所示的核苷酸序列，第二引物组包括如SEQ ID NO：85-194所示的核苷酸序列。
2.权利要求1所述引物组合物在制备生殖感染病原检测试剂盒中的应用。
3.生殖感染病原检测试剂盒，用于ONT测序平台测序，其特征在于，包括多重扩增引物组，和若干用于区分不同样本的barcode序列，所述多重扩增引物组包括权利要求1所述的引物组合物；所述引物组合物及barcode序列的每一条序列分别连接有公共序列。
4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述barcode序列为96个，核苷酸如SEQID NO：203-298所示。
5.根据权利要求3或4所述的试剂盒，其特征在于，所述公共序列的核苷酸序列如SEQID NO：299所示，分别与所述引物组合物的5’端和barcode序列的3’端连接。
6.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，还包括外质控引物和人源特
7.根据权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，所述外质控引物核苷酸序列如SEQ IDNO：197-200所示；和/或，所述人源特异性引物核苷酸序列如SEQ ID NO：201-202所示。
8.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述多重扩增引物组浓度为5-100nM。
9.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，还包括PCR反应液和用于构建测序文库的末端修复液、接头连接酶、缓冲液。
10.一种非诊断为目的检测生殖感染病原的方法，其特征在于，步骤包括：
...【技术特征摘要】
1.引物组合物，其特征在于，包括用于检测病原微生物的第一引物组，和用于hpv分型的第二引物组；第一引物组包括如seq id no：1-84、seq id no：195-196所示的核苷酸序列，第二引物组包括如seq id no：85-194所示的核苷酸序列。
2.权利要求1所述引物组合物在制备生殖感染病原检测试剂盒中的应用。
3.生殖感染病原检测试剂盒，用于ont测序平台测序，其特征在于，包括多重扩增引物组，和若干用于区分不同样本的barcode序列，所述多重扩增引物组包括权利要求1所述的引物组合物；所述引物组合物及barcode序列的每一条序列分别连接有公共序列。
4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述barcode序列为96个，核苷酸如seqid no：203-298所示。
5.根据权...
【专利技术属性】
技术研发人员：宋驰，王俊，范媛，聂旋，邱婷，蒋冕，田朝阳，余凯敏，郑重文，颜雪辉，郭睿，
申请(专利权)人：武汉贝纳科技有限公司，
类型：发明
国别省市：
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