【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及基因测序，特别涉及基于drs的生物遗传样本转录组测序分析方法。
技术介绍
1、对生物样本中的核糖核酸(rna)进行测序可以获得丰富的信息，包括细菌和病毒的身份、选择性剪接的细微差别或生物体的转录状态。目前大多数的rna测序技术只能产生相对较短的读取长度，多数方法仍需将rna反转录成cdna(互补脱氧核糖核酸)，这不仅会引入错误及偏好，而且效率不高，还会影响rna自身复杂结构的准确表征。传统的第二代高通量测序平台在分析转录组时存在一些限制，例如无法准确得到或组装出完整的转录本，难以区分和定量同源基因、超基因家族和等位基因表达的转录本，同时也无法直接获得转录本上的甲基化修饰信息和poly(a)尾长信息，从而限制了对生命活动的深层次理解。
2、为了克服这些限制，direct rna sequencing(drs)技术应运而生。drs是一种基于牛津纳米孔公司(oxford nanopore technologies，ont)的第三代测序平台的直接rna测序方法。与传统方法不同，drs不需要对rna进行反转录或扩增，可以避免引入假阳性转录本。drs可以检测单碱基的甲基化修饰(m5c、m6a、假尿苷等)及其修饰率、poly(a)尾长、可变剪切、融合基因等信息，反映rna的最原始信息，表征最全面的rna特征。drs一次测序，原始数据可终身使用，随着分析算法的更新，后续可用原始数据分析其他类型的甲基化修饰(m1a、2'-o-甲基化等)。
3、现有的基于drs的转录组三代测序方法，由于读长的限制，不能有效地实
技术实现思路
1、针对现有技术中存在的上述问题，本专利技术提供了一种基于drs的生物遗传样本转录组测序分析方法，利用nextflow与docker软件串行了一套完整、可移植的drs分析技术，能够更准确、更全面地分析rna特征，深入挖掘生命过程中的转录信息，从而为生命科学研究、医学诊断和药物开发等领域提供更多有价值的数据和应用。具体通过以下技术实现。
2、本专利技术提供的基于drs的生物遗传样本转录组测序分析方法，步骤包括：富集样本mrna，建立直接测序文库；
3、基于illumina进行二代测序，基于ont进行三代drs测序，分别得到二代原始测序数据和三代原始测序数据；
4、对所述二代原始测序数据和三代原始测序数据分别进行质控，基于所述二代原始测序数据对所述三代原始测序数据进行纠错校正；将纠错后的转录本序列与参考基因组进行比对，统计得到一致性序列；
5、过滤所述旧转录本中的全长reads，然后将一致性序列与参考基因组的已知转录本进行比对，得到新转录本和新基因；
6、识别所述新转录本的潜在编码区序列，预测所述新转录本和新基因的编码区序列，对所述新转录本和新基因进行功能注释；
7、对转录本的结构进行优化，进行可变剪切分析、融合转录本分析、lncrna预测、转录本表达定量分析、差异表达和功能富集分析、poly(a)分析、甲基化分析和假尿苷分析。
8、进一步地，对所述二代原始测序数据的质控方式为：
9、去除n碱基含量＞5％的reads；
10、并且，去除质量值≤5，碱基数目达到50％的reads；
11、并且，去除有adapter污染的reads；
12、并且，去除pcr扩增造成的重复序列；
13、对所述三代原始测序数据的质控方式为：过滤q＜9且长度＜100bp的reads。进一步地，基于所述二代原始测序数据，使用lrece软件中的run_correction_tools.sh脚本对所述三代原始测序数据进行纠错校正；
14、使用minimap2软件将纠错校正后的转录本序列与参考转录本进行比对，使用samtools软件统计比对结果，得到一致性序列。
15、进一步地，使用lafite软件在所述一致性序列中引入poly(a)鉴定标签过滤去除全长reads；使用gffcompare软件将所述一致性序列与基因组的已知转录本进行比对，发现新转录本和新基因。
16、进一步地，使用transdecoder软件对所述新转录本和新基因进行潜在编码区序列识别，使用orfpy软件对所述新转录本和新基因的编码区进行预测。
17、进一步地，对所述新转录本和新基因进行nr、pfam、uniprot、kegg、go、kog/cog和pathway七个数据库的转录本功能注释。
18、更进一步地，功能注释的方法包括：
19、使用diamond blastp软件将新转录本中转录本编码的蛋白序列与现有蛋白质数据库uniprot和nr进行比对，获得序列的功能信息，以及蛋白可能参与的代谢通路信息；基于数据库之间的关联，得到kog/cog注释结果，进行kog/cog的分类统计及绘图；
20、使用pfam数据库和hmmscan软件进行所述新转录本的结构域预测；使用kofam数据库和kofam_scan软件进行所述新转录本的同源性搜索。
21、进一步地，使用gffcompare软件，将一致性序列与基因组已知转录本进行比较；如果存在转录本在原有转录本边界之外的区域，则将转录本的非翻译区向上下游延伸，修正转录本的边界；通过比较结果，对基因的5’端或3’端进行延长，完成对转录本的结构优化。
22、进一步地，使用laser软件完成转录本的可变剪切分析；
23、使用ctat-lr-fusion软件比对、寻找融合转录本；
24、使用cnci软件、cpc2软件和plek软件对所述新转录本进行lncrna预测；
25、采用tpm作为衡量表达水平的指标，使用bamboo软件进行所述新转录本表达定量分析；
26、使用deseq2软件进行差异表达分析，筛选阈值为padj<0.05，且|log2foldchange|>1；若显著差异转录本数目＜10时，筛选阈值为pvalue<0.05，且|log2foldchange|>1；基于gene ontology和kegg pathway方法，使用clusterprofiler软件进行功能富集分析；
27、使用nanopolish软件对有效reads的poly(a)进行计算，使用minimap2软件将reads比对到参考基因组序列后，从bam文件中提取比对到参考基因组的终点位置，再使用quantifypoly(a)软件进行poly(a)位点的鉴定、聚类与注释；
28、使用tombo软件预测出rna分子序列中m5c修饰位点，使用m6anet软件预测出rna分子序列中m6a修饰位点，使用r语言计算并绘制甲基化位点的位置、分布、5bp的motif图，本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.基于DRS的生物遗传样本转录组测序分析方法，其特征在于，步骤包括：
2.根据权利要求1所述的基于DRS的生物遗传样本转录组测序分析方法，其特征在于，对所述二代原始测序数据的质控方式为：
3.根据权利要求1所述的基于DRS的生物遗传样本转录组测序分析方法，其特征在于，基于所述二代原始测序数据，使用LRECE软件中的run_correction_tools.sh脚本对所述三代原始测序数据进行纠错校正；
4.根据权利要求1所述的基于DRS的生物遗传样本转录组测序分析方法，其特征在于，使用LAFITE软件在所述一致性序列中引入poly(A)鉴定标签过滤去除全长reads；使用gffcompare软件将所述一致性序列与基因组的已知转录本进行比对，发现新转录本和新基因。
5.根据权利要求1所述的基于DRS的生物遗传样本转录组测序分析方法，其特征在于，使用TransDecoder软件对所述新转录本和新基因进行潜在编码区序列识别，使用orfpy软件对所述新转录本和新基因的编码区进行预测。
6.根据权利要求1所述的基于DRS的生物遗传
7.根据权利要求6所述的基于DRS的生物遗传样本转录组测序分析方法，其特征在于，功能注释的方法包括：
8.根据权利要求1所述的基于DRS的生物遗传样本转录组测序分析方法，其特征在于，使用gffcompare软件，将一致性序列与基因组已知转录本进行比较；如果存在转录本在原有转录本边界之外的区域，则将转录本的非翻译区向上下游延伸，修正转录本的边界；通过比较结果，对基因的5’端或3’端进行延长，完成对转录本的结构优化。
9.根据权利要求1所述的基于DRS的生物遗传样本转录组测序分析方法，其特征在于，使用LASER软件完成转录本的可变剪切分析；
...【技术特征摘要】
1.基于drs的生物遗传样本转录组测序分析方法，其特征在于，步骤包括：
2.根据权利要求1所述的基于drs的生物遗传样本转录组测序分析方法，其特征在于，对所述二代原始测序数据的质控方式为：
3.根据权利要求1所述的基于drs的生物遗传样本转录组测序分析方法，其特征在于，基于所述二代原始测序数据，使用lrece软件中的run_correction_tools.sh脚本对所述三代原始测序数据进行纠错校正；
4.根据权利要求1所述的基于drs的生物遗传样本转录组测序分析方法，其特征在于，使用lafite软件在所述一致性序列中引入poly(a)鉴定标签过滤去除全长reads；使用gffcompare软件将所述一致性序列与基因组的已知转录本进行比对，发现新转录本和新基因。
5.根据权利要求1所述的基于drs的生物遗传样本转录组测序分析方法，其特征在于，使用transdecoder软件对所述新转录本和新基因进行潜在编码区序列...
【专利技术属性】
技术研发人员：杨柳，田朝阳，郭登理，蒋冕，李晓静，曾维科，冀金龙，樊鹏宇，陈洁，
申请(专利权)人：武汉贝纳科技有限公司，
类型：发明
国别省市：
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