一种低分子量麦谷蛋白亚基的提取分离鉴定方法技术

本发明专利技术公开了一种低分子量麦谷蛋白亚基的提取分离鉴定方法。该分离麦谷蛋白亚基的方法，包括如下步骤：将待分离的麦谷蛋白进行双向电泳，得到分离的麦谷蛋白亚基；所述双向电泳中，进行电泳的上样液是用含有ＤＴＴ的水合上样缓冲液溶解所述待分离的麦谷蛋白得到的。本发明专利技术方法具体的提供了适合双向电泳的低分子量麦谷蛋白的提取和适合质谱鉴定的蛋白质胶内酶切的技术方案，解决了小麦低分子量麦谷蛋白亚基的分离鉴定技术问题，也为同类型新的蛋白的分离鉴定提供了一种切实有效的方法，因此，本发明专利技术方法适合于推广应用。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及。
技术介绍
小麦是世界上的主要粮食作物，是我国的第三大类粮食作物，在人类生存和国家 粮食安全中起着十分重要的作用。小麦籽粒含有丰富的营养成分，其中蛋白质约占籽粒营 养成分的8% 10%，包括水溶性的清蛋白、盐溶性的球蛋白、醇溶性的醇溶蛋白及溶于酸 或碱的麦谷蛋白类。清蛋白和球蛋白主要存在于小麦种子的胚和糊粉层中，约占籽粒蛋白 的15%左右，在加工后得到的面粉中含量很少，对小麦面粉加工品质的影响比较小。醇溶 蛋白和麦谷蛋白是小麦胚乳中的主要储藏蛋白，约占籽粒蛋白的85 %，是小麦面粉中的主 要蛋白，与小麦面粉加工品质密切相关。其中，醇溶蛋白是单体蛋白，主要影响面团的粘性， 而麦谷蛋白可以形成多聚体蛋白，主要影响面团的弹性。小麦的麦谷蛋白按其分子量大小 又分为高分子量麦谷蛋白亚基(high molecularweight glutenin subunits，简称HMW-GS) 和低分子量麦谷蛋白亚基(low molecularweight glutenin subunits，简称LMW-GS)，其中 LMW-GS是面筋的主要成份，对小麦面粉加工品质起着重要的作用，主要影响面筋的强度和 延展性。SDS-PAGE(Sodium Dodecyl Sulfate Polyacrylamide Gel Electrophoresis, 十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳)是蛋白质分离中常用的实验技术，其仪器简单、操 作方便、重复性好，在麦谷蛋白的分离鉴定中得到了广泛的应用，特别是在高分子量麦谷蛋 白的分离和命名中发挥了很大的作用。但是小麦LMW-GS的组成比较复杂，种类较多，分子 量大小相似，在SDS-PAGE图谱中迁移率差别很小，难以进行有效的分离和鉴定。随着双向电泳技术和质谱技术的发展以及蛋白质组学技术平台的建立，基于双 向电泳和质谱分析的蛋白质组学技术在分析小麦种子蛋白的研究中发挥着越来越大的作 用。双向电泳(2-DE)又称为等电聚焦双向聚丙烯酰胺凝胶电泳(IEF-SDS-PAGE)，在20世 纪70年代中期建立并开始广泛应用，是目前唯一能将数千种蛋白质同时分离与展示的技 术。其原理是，蛋白质首先根据等电点的不同在第一向等电聚焦电泳中分离，然后被转移到 SDS-PAGE中，根据分子量的大小进行第二向分离。质谱(Massspectrometry，MS)分析法是 通过测定样品离子的质荷比(m/z)来进行成分和结构分析的方法，可以将2-DE分离得到的 蛋白质进行有效地鉴定，目前基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-T0F MS)和液相 色谱-电喷雾-串联质谱(LC-ESI-MS/MS)的检测效果较好，应用很广泛。近年来，基于双 向电泳结合质谱技术的蛋白质组学方法在分离小麦LMW-GS的研究中得到了很好的应用。蛋白质双向电泳的第一向凝胶电泳为等电聚焦，根据不同蛋白质本身所带有电荷 的不同将它们进行分离。在麦谷蛋白的提取过程中多使用SDS(十二烷基磺酸钠)来提高 提取效率。而SDS能与蛋白质牢固地结合，改变蛋白质本身所带的电荷，进而影响第一向等 电聚焦，所以，在LMW-GS提取中应尽可能避免使用SDS。在Singh等(1991)提出的麦谷蛋 白提取方法中，仅使用异丙醇和Tris碱，最大限度地减少了对蛋白的修饰。但在用DTT将麦谷蛋白中的二硫键还原后，要用4-乙烯吡啶(4-VP)对还原得到的巯基进行修饰保护，防 止自由巯基的再氧化。我们发现4-VP的修饰可以改变蛋白质的等电点，影响等电聚焦，进 而影响2-DE的效果。与正常条件下的分析结果相比，4-VP修饰改变了 LMW-GS的等电点，超 出了 IPG胶条的pH值(3-10)范围，导致蛋白质在等电聚焦时迁移到了胶条之外，致使等电 聚焦过程失败，即在2-DE图谱中，VP修饰后的大多数蛋白点聚集于碱性端，很多本应出现 的蛋白点丢失了(如图1)。利用质谱对蛋白凝胶中的蛋白质进行鉴定的基本思路是使用蛋白酶将凝胶中的 蛋白切割成大小适中的肽段，再将肽段回收，然后利用质谱测定得到肽段的分子量，产生 质谱峰图，质谱峰图中的信号峰与蛋白点酶切后得到肽段的质量数是一一对应的。在常规 的蛋白质组学研究中，普遍使用的蛋白酶是胰蛋白酶，因为胰蛋白酶可以特异识别氨基酸 K和R，而且K和R在大多数蛋白质中的数量适中和分布较均勻，可以得到合适大小(m/z， 900-3600)的酶切肽段。麦谷蛋白是指禾谷作物的种子中溶于稀酸或稀碱，但不溶于水、盐及醇溶液的蛋 白质组分，是由多个亚基通过分子间二硫键相互连接成的大分子物质，麦谷蛋白在稀酸或 稀碱溶液中的溶解性随肽链上二硫键数目的增加而减小。麦谷蛋白按其分子量高低可分为高分子量麦谷蛋白亚基(分子量为60kD以上) 和低分子量麦谷蛋白亚基(分子量一般为30-45kD)。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种分离麦谷蛋白亚基的方法。本专利技术所提供的分离麦谷蛋白亚基的方法，包括如下步骤将待分离的麦谷蛋白 进行双向电泳，得到分离的麦谷蛋白亚基；所述双向电泳中，进行电泳的上样液是用含有 DTT的水合上样缓冲液溶解所述待分离的麦谷蛋白得到的。上述分离麦谷蛋白亚基的方法中，所述DTT在所述水合上样缓冲液中的浓度为 20mM-65mM,具体为 65mM 或 20mM。上述分离麦谷蛋白亚基的方法中，所述待分离的麦谷蛋白是按照包括如下步骤的 方法提取得到的(1)从待提取物质中提取总蛋白；(2)从步骤(1)得到的蛋白中去除醇溶 蛋白；(3)再用麦谷蛋白提取缓冲液从步骤(2)得到的蛋白中提取麦谷蛋白，得到麦谷蛋 白；所述麦谷蛋白提取缓冲液由异丙醇、Tris-HCl缓冲液、DTT和水组成。上述分离麦谷蛋白亚基的方法中，所述待分离的麦谷蛋白的提取方法中，在所述 步骤(1)之前，包括如下步骤用TCA的丙酮溶液浸泡所述待提取物质，离心，收集沉淀，从 沉淀中提取总蛋白；所述水合上样缓冲液由尿素、硫脲、CHAPS、DTT、pH值范围为3_10的IPG buffer、 pH值范围为6-11的IPG buffer和水组成。上述分离麦谷蛋白亚基的方法中，每升所述麦谷蛋白提取缓冲液由500ml异丙 醇、12. 5ml pH值为8. 0的IM Tris-HCl缓冲液、65mmol DTT和水组成；上述分离麦谷蛋白亚基的方法中，每1升所述水合上样缓冲液由6mol尿素、2mol 硫脲、40g CHAPS、20mmol-65mmol DTT、5ml pH值范围为 3-10 的 IPG buffer、1. 25mlpH值范围为6-11的IPG buffer和水组成；所述DTT具体为20mmol ；上述分离麦谷蛋白亚基的方法中，所述TCA的丙酮溶液中，TCA的浓度为10% (质 量百分含量)；所述浸泡的温度为_20°C，所述浸泡的时间为2小时；上述分离麦谷蛋白亚基的方法中，所述双向电泳中，第一向是等电聚焦电泳，第二 向是SDS电泳；上述分离麦谷蛋白亚基的方法中，所述麦谷蛋白亚基为高分子量麦谷蛋白亚基或 低分子量麦谷蛋白亚基；上述分离麦谷蛋白亚基的方法中，所述待提取物质为麦类作物的去胚后的种子；上述分离麦谷蛋白亚基的方法中，所述麦类作物为小麦、大麦或黑麦。上述分离麦谷蛋白亚基的方法中本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种分离麦谷蛋白亚基的方法，包括如下步骤：将待分离的麦谷蛋白进行双向电泳，得到分离的麦谷蛋白亚基；所述双向电泳中，进行电泳的上样液是用含有ＤＴＴ的水合上样缓冲液溶解所述待分离的麦谷蛋白得到的。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：张爱民，阳文龙，张肖飞，刘冬成，孙家柱，郭小丽，张相岐，王道文，
申请(专利权)人：中国科学院遗传与发育生物学研究所，
类型：发明
国别省市：11[中国|北京]