【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本pct申请要求2021年4月15日提交的美国临时申请第63/175,459号的优先权权益，所述申请以引用的方式整体并入本文。对经由efs-web以电子方式提交的序列表的引用在本申请中提交的以电子方式提交的序列表(名称：4366_028pc01_seqlisting_st25.txt，大小：124,555字节；并且创建日期：2022年4月15日)的内容以引用的方式整体并入本文。本公开提供了能够诱导所编码蛋白质的增强表达的经修饰的多核苷酸，以及此类多核苷酸用于治疗各种疾病和病症的用途。
技术介绍
1、疫苗对世界卫生产生了深远的影响。例如，天花已经根除，并且小儿麻痹症也接近消除。尽管如此，正如最近的冠状病毒大流行所证明的那样，仍有许多人类病原体尚未被成功遏制。此外，常规疫苗接种策略通常涉及施用“活”(减毒)或“死”疫苗。此类疫苗通常具有不期望的副作用和风险(例如，减毒活疫苗可回复为致病性生物体)或具有有限的功效。
2、最近，人们对使用多核苷酸作为疫苗平台(例如，dna和mrna疫苗)产生了很大兴趣。与常规疫苗相比，基于多核苷酸的疫苗通常更安全，更容易制造，并且能够诱导更广泛的免疫反应。然而，通一般而言，此类疫苗具有有限的功效，特别是在人中。参见hobernik等人,int j mol sci 19(11):3605(2018年11月)。因此，迄今为止，仍然没有dna疫苗被批准用于人类使用。此外，只是由于最近的大流行，三种冠状病毒特异性mrna疫苗才获得批准。因此，仍然需要用于人类使用的具有更大效力的新的基于多核苷酸的疫苗
技术实现思路
1、本文提供了一种分离的多核苷酸，所述分离的多核苷酸包含开放阅读框(orf)和(i)流感血凝素(ha)蛋白的5'-非翻译区元件(5'-utr)、(ii)流感血凝素(ha)蛋白的3'-非翻译区元件(3'-utr)、或(i)和(ii)两者；其中所述orf编码与所述5'-utr、所述3'-utr或所述5'-utr和所述3'-utr两者异源的蛋白质。在一些方面中，分离的多核苷酸包含5'-utr和3'-utr两者。
2、在一些方面中，5'-utr包含seq id no:13(agcaaaagcaggggaaaataaaagcaacaaaa)中所示的核酸序列。在一些方面中，5'-utr由seq id no:13(agcaaaagcaggggaaaataaaa gcaacaaaa)中所示的核酸序列组成。在一些方面中，3'-utr包含seq id no:14(cattaggatttcagaagcatgagaaaaacacc cttgtttctact)中所示的核酸序列。在一些方面中，3'-utr由seq id no:14(cattaggatttcagaagcatgagaaaaacacccttgtttctact)中所示的核酸序列组成。
3、在一些方面中，与用不包含5'-utr和3'-utr两者的参考多核苷酸转染的细胞中的相应表达相比，当在细胞中转染时，5'-utr、3'-utr或5'-utr和3'-utr两者能够增加由orf编码的异源蛋白质的表达。
4、在一些方面中，本公开的分离的多核苷酸还包含5'-帽、poly(a)尾、至少一个翻译增强子元件(tee)、翻译起始序列、至少一个微小rna结合位点或其种子、连接的核苷的3'加尾区、富含au的元件(are)、转录后控制调节因子或它们的组合。
5、在一些方面中，5’-帽包括m2 7,2′-ogppspgrna、m7gpppg、m7gppppm7g、m2(7,3′-o)gpppg、m2(7,2′-o)gppspg(d1)、m2(7,2′-o)gppspg(d2)、m27,3’-ogppp(m12’-o)apg、(m7g-3′mppp-g；其可等效地指定为3′o-me-m7g(5′)ppp(5′)g)、n7,2′-o-二甲基-鸟苷-5′-三磷酸-5′-鸟苷、m7gm-ppp-g、n7-(4-氯苯氧基乙基)-g(5′)ppp(5′)g、n7-(4-氯苯氧基乙基)-m3′-og(5′)ppp(5′)g、7mg(5′)ppp(5′)n,pn2p、7mg(5′)ppp(5′)nlmpnp、7mg(5′)-ppp(5′)nlmpn2 mp、m(7)gpppm(3)(6,6,2′)apm(2′)apm(2′)cpm(2)(3,2′)up、肌苷、n1-甲基-鸟苷、2′氟-鸟苷、7-脱氮-鸟苷、8-氧代-鸟苷、2-氨基-鸟苷、lna-鸟苷、2-叠氮基-鸟苷、n1-甲基假尿苷、m7g(5')ppp(5')(2'omea)pg或它们的组合。在一些方面中，连接的核苷的3'加尾区包含poly-a尾、polya-g四联体或茎环序列。
6、在一些方面中，本公开的分离的多核苷酸包含至少一个经修饰的或非天然存在的核苷酸。在某些方面中，至少一个经修饰的或非天然存在的核苷酸包括6-氮杂-胞苷、2-硫代-胞苷、α-硫代-胞苷、假异胞苷、5-氨基烯丙基-尿苷、5-碘代-尿苷、n1-甲基-假尿苷、5,6-二氢尿苷、α-硫代-尿苷、4-硫代-尿苷、6-氮杂-尿苷、5-羟基-尿苷、脱氧-胸苷、假尿苷、肌苷、α-硫代-鸟苷、8-氧代-鸟苷、o6-甲基-鸟苷、7-脱氮-鸟苷、n1-甲基腺苷、2-氨基-6-氯-嘌呤、n6-甲基-2-氨基-嘌呤、6-氯-嘌呤、n6-甲基-腺苷、α-硫代-腺苷、8-叠氮基-腺苷、7-脱氮-腺苷、吡咯并-胞苷、5-甲基-胞苷、n4-乙酰基-胞苷、5-甲基-尿苷、5-碘代-胞苷或它们的组合。
7、在一些方面中，由本文所述的分离的多核苷酸的orf编码的异源蛋白质包含冠状病毒蛋白。在一些方面中，冠状病毒蛋白包括sars-cov-2刺突蛋白。
8、在一些方面中，由本文所述的分离的多核苷酸的orf编码的异源蛋白质包含流感蛋白。在某些方面中，流感蛋白包括ha蛋白、神经氨酸酶(na)蛋白、核蛋白(np)、基质1(m1)蛋白、基质2(m2)蛋白、非结构蛋白1(ns1)、非结构蛋白2(ns2)、聚合酶酸性(pa)蛋白、聚合酶碱性1(pb1)蛋白、pb1-f2蛋白、聚合酶碱性2(pb2)蛋白或它们的任何组合。
9、在一些方面中，由orf编码的异源蛋白质包含肿瘤抗原。在一些方面中，肿瘤抗原包括甲胎蛋白(afp)、b细胞成熟抗原(bcma)、癌胚抗原(cea)、上皮肿瘤抗原(eta)、粘蛋白1(muc1)、tn-muc1、粘蛋白16(muc16)、酪氨酸酶、黑素瘤相关抗原(mage；例如，magea3)、肿瘤蛋白p53(p53)、cd4、cd8、cd45、cd80、cd86、程序性死亡配体1(pd-l1)、程序性死亡配体2(pd-l2)、前列腺特异性膜抗原(psma)、tag-72、人表皮生长因子受体2(her2)、gd2、cmet、egfr、间皮素、vegfr、α-叶酸受体、ce7r、il-3、癌症-睾丸抗原(例如，纽约食管鳞状细胞癌1(ny-eso-1)、mart-1gp100、ror1、ror2本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种分离的多核苷酸，所述分离的多核苷酸包含开放阅读框(ORF)和(i)流感血凝素(HA)蛋白的5'-非翻译区元件(5'-UTR)、(ii)流感血凝素(HA)蛋白的3'-非翻译区元件(3'-UTR)、或(i)和(ii)两者；其中所述ORF编码与所述5'-UTR、所述3'-UTR或所述5'-UTR和所述3'-UTR两者异源的蛋白质。
2.如权利要求1所述的分离的多核苷酸，所述分离的多核苷酸包含所述5'-UTR和所述3'-UTR两者。
3.如权利要求1或2所述的分离的多核苷酸，其中所述5'-UTR包含SEQ ID NO:13(AGCAAAAGCAGGGGAAAATAAAAGCAAC AAAA)中所示的核酸序列。
4.如权利要求1至3中任一项所述的分离的多核苷酸，其中所述5'-UTR由SEQ ID NO:13(AGCAAAAGCAGGGGAAAATAAAAG CAACAAAA)中所示的核酸序列组成。
5.如权利要求1至5中任一项所述的分离的多核苷酸，其中所述3'-UTR包含SEQ ID NO:14(CATTAGGATTTCAGAAGCA
6.如权利要求1至5中任一项所述的分离的多核苷酸，其中所述3'-UTR由SEQ ID NO:14(CATTAGGATTTCAGAAGCATGAGAA AAACACCCTTGTTTCTACT)中所示的核酸序列组成。
7.如权利要求1至6中任一项所述的分离的多核苷酸，其中与用不包含所述5'-UTR和所述3'-UTR两者的参考多核苷酸转染的细胞中的相应表达相比，当在细胞中转染时，所述5'-UTR、所述3'-UTR或所述5'-UTR和所述3'-UTR两者能够增加由所述ORF编码的所述异源蛋白质的表达。
8.如权利要求1至7中任一项所述的分离的多核苷酸，所述分离的多核苷酸还包含5'-帽、poly(A)尾、至少一个翻译增强子元件(TEE)、翻译起始序列、至少一个微小RNA结合位点或其种子、连接的核苷的3'加尾区、富含AU的元件(ARE)、转录后控制调节因子或它们的组合。
9.如权利要求8所述的分离的多核苷酸，其中所述5’-帽包括m27,2′-OGppspGRNA、m7GpppG、m7Gppppm7G、m2(7,3′-O)GpppG、m2(7,2′-O)GppspG(D1)、m2(7,2′-O)GppspG(D2)、m27,3’-OGppp(m12’-O)ApG、(m7G-3′mppp-G；其可等效地指定为3′O-Me-m7G(5′)ppp(5′)G)、N7,2′-O-二甲基-鸟苷-5′-三磷酸-5′-鸟苷、m7Gm-ppp-G、N7-(4-氯苯氧基乙基)-G(5′)ppp(5′)G、N7-(4-氯苯氧基乙基)-m3′-OG(5′)ppp(5′)G、7mG(5′)ppp(5′)N,pN2p、7mG(5′)ppp(5′)NlmpNp、7mG(5′)-ppp(5′)NlmpN2 mp、m(7)Gpppm(3)(6,6,2′)Apm(2′)Apm(2′)Cpm(2)(3,2′)Up、肌苷、N1-甲基-鸟苷、2′氟-鸟苷、7-脱氮-鸟苷、8-氧代-鸟苷、2-氨基-鸟苷、LNA-鸟苷、2-叠氮基-鸟苷、N1-甲基假尿苷、m7G(5')ppp(5')(2'OMeA)pG或它们的组合。
10.如权利要求8或9所述的分离的纳米颗粒，其中所述连接的核苷的3'加尾区包含poly-A尾、polyA-G四联体或茎环序列。
11.如权利要求1至8中任一项所述的分离的多核苷酸，所述分离的多核苷酸包含至少一个经修饰的或非天然存在的核苷酸。
12.如权利要求11所述的分离的多核苷酸，其中所述至少一个经修饰的或非天然存在的核苷酸包括6-氮杂-胞苷、2-硫代-胞苷、α-硫代-胞苷、假异胞苷、5-氨基烯丙基-尿苷、5-碘代-尿苷、N1-甲基-假尿苷、5,6-二氢尿苷、α-硫代-尿苷、4-硫代-尿苷、6-氮杂-尿苷、5-羟基-尿苷、脱氧-胸苷、假尿苷、肌苷、α-硫代-鸟苷、8-氧代-鸟苷、O6-甲基-鸟苷、7-脱氮-鸟苷、N1-甲基腺苷、2-氨基-6-氯-嘌呤、N6-甲基-2-氨基-嘌呤、6-氯-嘌呤、N6-甲基-腺苷、α-硫代-腺苷、8-叠氮基-腺苷、7-脱氮-腺苷、吡咯并-胞苷、5-甲基-胞苷、N4-乙酰基-胞苷、5-甲基-尿苷、5-碘代-胞苷或它们的组合。
13.如权利要求1至12中任一项所述的分离的多核苷酸，其中由所述ORF编码的所述异源蛋白质包含冠状病毒蛋白。
14.如权利要求13所述的分离的多核苷酸，其中所述...
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】
1.一种分离的多核苷酸，所述分离的多核苷酸包含开放阅读框(orf)和(i)流感血凝素(ha)蛋白的5'-非翻译区元件(5'-utr)、(ii)流感血凝素(ha)蛋白的3'-非翻译区元件(3'-utr)、或(i)和(ii)两者；其中所述orf编码与所述5'-utr、所述3'-utr或所述5'-utr和所述3'-utr两者异源的蛋白质。
2.如权利要求1所述的分离的多核苷酸，所述分离的多核苷酸包含所述5'-utr和所述3'-utr两者。
3.如权利要求1或2所述的分离的多核苷酸，其中所述5'-utr包含seq id no:13(agcaaaagcaggggaaaataaaagcaac aaaa)中所示的核酸序列。
4.如权利要求1至3中任一项所述的分离的多核苷酸，其中所述5'-utr由seq id no:13(agcaaaagcaggggaaaataaaag caacaaaa)中所示的核酸序列组成。
5.如权利要求1至5中任一项所述的分离的多核苷酸，其中所述3'-utr包含seq id no:14(cattaggatttcagaagcatgag aaaaacacccttgtttctact)中所示的核酸序列。
6.如权利要求1至5中任一项所述的分离的多核苷酸，其中所述3'-utr由seq id no:14(cattaggatttcagaagcatgagaa aaacacccttgtttctact)中所示的核酸序列组成。
7.如权利要求1至6中任一项所述的分离的多核苷酸，其中与用不包含所述5'-utr和所述3'-utr两者的参考多核苷酸转染的细胞中的相应表达相比，当在细胞中转染时，所述5'-utr、所述3'-utr或所述5'-utr和所述3'-utr两者能够增加由所述orf编码的所述异源蛋白质的表达。
8.如权利要求1至7中任一项所述的分离的多核苷酸，所述分离的多核苷酸还包含5'-帽、poly(a)尾、至少一个翻译增强子元件(tee)、翻译起始序列、至少一个微小rna结合位点或其种子、连接的核苷的3'加尾区、富含au的元件(are)、转录后控制调节因子或它们的组合。
9.如权利要求8所述的分离的多核苷酸，其中所述5’-帽包括m27,2′-ogppspgrna、m7gpppg、m7gppppm7g、m2(7,3′-o)gpppg、m2(7,2′-o)gppspg(d1)、m2(7,2′-o)gppspg(d2)、m27,3’-ogppp(m12’-o)apg、(m7g-3′mppp-g；其可等效地指定为3′o-me-m7g(5′)ppp(5′)g)、n7,2′-o-二甲基-鸟苷-5′-三磷酸-5′-鸟苷、m7gm-ppp-g、n7-(4-氯苯氧基乙基)-g(5′)ppp(5′)g、n7-(4-氯苯氧基乙基)-m3′-og(5′)ppp(5′)g、7mg(5′)ppp(5′)n,pn2p、7mg(5′)ppp(5′)nlmpnp、7mg(5′)-ppp(5′)nlmpn2 mp、m(7)gpppm(3)(6,6,2′)apm(2′)apm(2′)cpm(2)(3,2′)up、肌苷、n1-甲基-鸟苷、2′氟-鸟苷、7-脱氮-鸟苷、8-氧代-鸟苷、2-氨基-鸟苷、lna-鸟苷、2-叠氮基-鸟苷、n1-甲基假尿苷、m7g(5')ppp(5')(2'omea)pg或它们的组合。
10.如权利要求8或9所述的分离的纳米颗粒，其中所述连接的核苷的3'加尾区包含poly-a尾、polya-g四联体或茎环序列。
11.如权利要求1至8中任一项所述的分离的多核苷酸，所述分离的多核苷酸包含至少一个经修饰的或非天然存在的核苷酸。
12.如权利要求11所述的分离的多核苷酸，其中所述至少一个经修饰的或非天然存在的核苷酸包括6-氮杂-胞苷、2-硫代-胞苷、α-硫代-胞苷、假异胞苷、5-氨基烯丙基-尿苷、5-碘代-尿苷、n1-甲基-假尿苷、5,6-二氢尿苷、α-硫代-尿苷、4-硫代-尿苷、6-氮杂-尿苷、5-羟基-尿苷、脱氧-胸苷、假尿苷、肌苷、α-硫代-鸟苷、8-氧代-鸟苷、o6-甲基-鸟苷、7-脱氮-鸟苷、n1-甲基腺苷、2-氨基-6-氯-嘌呤、n6-甲基-2-氨基-嘌呤、6-氯-嘌呤、n6-甲基-腺苷、α-硫代-腺苷、8-叠氮基-腺苷、7-脱氮-腺苷、吡咯并-胞苷、5-甲基-胞苷、n4-乙酰基-胞苷、5-甲基-尿苷、5-碘代-胞苷或它们的组合。
13.如权利要求1至12中任一项所述的分离的多核苷酸，其中由所述orf编码的所述异源蛋白质包含冠状病毒蛋白。
14.如权利要求13所述的分离的多核苷酸，其中所述冠状病毒蛋白包括sars-cov-2刺突蛋白。
15.如权利要求3至12中任一项所述的分离的多核苷酸，其中由所述orf编码的所述异源蛋白质包含流感蛋白。
16.如权利要求15所述的分离的多核苷酸，其中所述流感蛋白包括ha蛋白、神经氨酸酶(na)蛋白、核蛋白(np)、基质1(m1)蛋白、基质2(m2)蛋白、非结构蛋白1(ns1)、非结构蛋白2(ns2)、聚合酶酸性(pa)蛋白、聚合酶碱性1(pb1)蛋白、pb1-f2蛋白、聚合酶碱性2(pb2)蛋白或它们的任何组合。
17.如权利要求1至12中任一项所述的分离的多核苷酸，其中由所述orf编码的所述异源蛋白质包含肿瘤抗原。
18.如权利要求17所述的分离的多核苷酸，其中所述肿瘤抗原包括甲胎蛋白(afp)、b细胞成熟抗原(bcma)、癌胚抗原(cea)、上皮肿瘤抗原(eta)、粘蛋白1(muc1)、tn-muc1、粘蛋白16(muc16)、酪氨酸酶、黑素瘤相关抗原(mage；例如，magea3)、肿瘤蛋白p53(p53)、cd4、cd8、cd45、cd80、cd86、程序性死亡配体1(pd-l1)、程序性死亡配体2(pd-l2)、前列腺特异性膜抗原(psma)、tag-72、人表皮生长因子受体2(her2)、gd2、cmet、egfr、间皮素、vegfr、α-叶酸受体、ce7r、il-3、癌症-睾丸抗原(例如，纽约食管鳞状细胞癌1(ny-eso-1)、mart-1gp100、ror1、ror2、磷脂酰肌醇蛋白聚糖-2、磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3、tnf相关细胞凋亡诱导配体或它们的组合。
19.如权利要求1至12中任一项所述的分离的多核苷酸，其中由所述orf编码的所述异源蛋白质包含与遗传病症相关的蛋白质。
20.如权利要求19所述的分离的多核苷酸，其中所述遗传病症包括亨特综合征。
21.一种分离的多核苷酸，所述分离的多核苷酸从5'至3'包含：
22.一种载体，所述载体包含如权利要求1至21中任一项所述的分离的多核苷酸。
23.一种细胞，所述细胞包含如权利要求1至21中任一项所述的分离的多核苷酸或如权利要求22所述的载体。
24.一种药物组合物，所述药物组合物包含(i)如权利要求1至21中任一项所述的分离的多核苷酸、如权利要求22所述的载体或如权利要求23所述的细胞；和(ii)药学上可接受的赋形剂。
25.一种药盒，所述药盒包含(i)如权利要求1至21中任一项所述的分离的多核苷酸、如权利要求22所述的载体或如权利要求23所述的细胞；和(ii)使用说明书。
26.一种治疗有需要的受试者的疾病或病症的方法，所述方法包括向所述受试者施用如权利要求1至21中任一项所述的分离的多核苷酸。
27.如权利要求26所述的方法，其中所述疾病或病症包括病毒感染、癌症、遗传病症或它们的组合。
28.如权利要求27所述的方法，其中所述病毒感染包括冠状病毒感染、流感病毒感染或两者。
29.如权利要求27所述的方法，其中所述癌症包括乳腺癌、头颈癌、子宫癌、脑癌、皮肤癌、肾癌、肺癌、结肠直肠癌、前列腺癌、肝癌、膀胱癌、肾癌、胰腺癌、甲状腺癌、食管癌、眼癌、胃(胃)癌、胃肠癌、癌、肉瘤、白血病、淋巴瘤、骨髓瘤或它们的组合。
30.如权利要求27所述的方法，其中所述遗传病症包括亨特综合征。
31.一种诱导有需要的受试者的免疫反应的方法，所述方法包括向所述受试者施用如权利要求1至21中任一项所述的分离的多核苷酸，其中在所述施用后，在所述受试者中诱导针对由所述orf编码的所述异源蛋白质的免疫反应。
32.一种增加蛋白质的表达的方法，所述方法包括使细胞与如权利要求1至21中任一项所述的分离的多核苷酸接触。
33.如权利要求32所述的方法，其中所述接触在体内发生。
34.如权利要求32所述的方法，其中所述接触离体发生。
35.如权利要求32至34中任一项所述的方法，其中与所述蛋白质在与不包含所述5'-utr和所述3'-utr两者的参考多核苷酸接触的细胞中的表达相比，所述蛋白质的表达增加至少约0.5倍、约1倍、约2倍、约3倍、约4倍、约5倍、约10倍、约20倍、约30倍、约40倍或约50倍。
36.如权利要求26至35中任一项所述的方法，其中所述分离的多核苷酸在递送剂中递送。
37.如权利要求36所述的方法，其中所述递送剂包括胶束、外泌体、类脂质、脂质体、脂质复合物、脂质纳米颗粒、细胞外囊泡、合成囊泡、聚合化合物、肽、蛋白质、细胞、纳米颗粒模拟物、纳米管、缀合物、病毒载体或它们的组合。
38.如权利要求36或37所述的方法，其中所述递送剂包含阳离子载体单元，所述阳离子载体单元包含：
39.如权利要求38所述的方法，其中当混合在一起时，所述阳离子载体单元和所述分离的多核苷酸能够彼此缔合以形成胶束。
40.如权利要求39所述的方法，其中所述缔合是通过共价键。
41.如权利要求39所述的方法，其中所述缔合是通过非共价键。
42.如权利要求41所述的方法，其中所述非共价键包括离子键。
43.如权利要求38至42中任一项所述的方法，其中所述水溶性聚合物包括聚(亚烷基二醇)...
【专利技术属性】
技术研发人员：柳金孝，李桑莫，金恩禾，成乐均，闵贤洙，林云娜，
申请(专利权)人：生物欧赛加有限责任公司，
类型：发明
国别省市：
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