【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于病毒检测，具体涉及一种基于荧光raa技术检测pedv m基因的方法及应用。
技术介绍
1、猪流行性腹泻病毒(porcine epidemic diarrhea virus，pedv)是一种主要感染猪类的冠状病毒，pedv感染可引起仔猪急性腹泻和呕吐，导致仔猪的高死亡率，对全球养猪业造成严重损失。据流行病学调查结果显示，我国大部分猪场都使用了tgev-pedv二联疫苗(基于cv777)，但pedv的检出率仍然较高，说明疫苗不能针对现有的流行毒株提供有效的免疫保护。因此，为了及早发现感染病例并采取有效的控制措施，快速、便捷的检测方法显得至关重要。
2、目前，常见的检测方法有pcr、rt-pcr、荧光rt-pcr、elisa等，但是这些方法各具有一定的缺陷，例如pcr、rt-pcr、荧光rt-pcr具有高度敏感性，能够检测病毒核酸，但高度依赖荧光pcr/pcr等仪器，这导致无检测设备的养殖场无法使用该方法，不适应用临床推广；elisa可以检测抗体，但特异性和灵敏度有限，同时也需要配备相应的酶标仪才能完成结果判读。重组酶介导核酸等温扩增(recombinase-aid amplification，raa)技术能够在37～42℃的恒温条件下于30min内快速完成扩增。与传统的pcr经过变性、退火、延伸三个步骤进行的扩增相比，raa的扩增避免了变性过程，缩短了反应时间，且在恒温环境下即可反应，无需pcr仪器提供的温度梯度。有望实现不依赖pcr仪器支持，使之成为小型养殖场等场景中广泛应用的技术。
3、部分
技术实现思路
1、有鉴于此，为了解决现有pedv的分子检测技术的所存在的检测时间长、操作难度大等技术问题，提升pedv的检测灵敏度和特异性，本专利技术提出了一种猪流行性腹泻病毒荧光raa检测方法、检测试剂及应用，该方法具有操作简单，检测时间短，灵敏度高，特异性好的特点。
2、本专利技术的目的之一在于提供一种基于荧光raa法检测猪流行性腹泻病毒的组合物。
3、为实现上述目的，本专利技术采用以下技术方案：
4、基于荧光raa法检测猪流行性腹泻病毒m基因的组合物，所述组合物包括上游引物、下游引物和探针；所述上游引物的核苷酸序列如seq id no：13所示；所述下游引物的核苷酸序列如seq id no：4所示；所述探针的核苷酸序列如seq id no：16所示。
5、pedv的基因组由正链单股rna组成，基因组包括至少7个开放阅读框(orfs)，分别编码4种结构蛋白，分别为纤突蛋白s、小膜蛋白e、膜糖蛋白m和核衣壳蛋白n。m基因和n基因通常被认为具有较高的保守性。但不同pedv毒株之间的n基因序列略有差异，强毒和弱毒之间差异较大，lee c等人在《genetic differentiation of the nucleocapsid protein ofkorean isolates of porcine epidemic diarrhoea virus by rt-pcr basedrestriction fragment length polymorphism analysis》中证实，临床分离株和疫苗毒株的n基因存在一定程度的差异。与n基因相比，不同pedv毒株之间的m基因却很保守，不同冠状病毒间m蛋白同源性较低，因此m基因具备良好的保守性和特异性。这意味着pedv m是更为理想的分子检测靶标。基于对pedv基因组的深刻理解，本研究以m基因作为pedv分子检测的目标，利用m基因序列的保守性来设计特异性引物和探针，用于pedv的检测和分析。
6、进一步，所述探针的5’-端采用fitc进行修饰，3’-端采用c3 spacer进行修饰，中间/thf/间隔及bhq修饰。
7、本专利技术的目的之二在于提供一种基于荧光raa法检测猪流行性腹泻病毒m基因的试剂盒。
8、为实现上述目的，本专利技术采用以下技术方案：
9、基于荧光raa法检测猪流行性腹泻病毒m基因的试剂盒，所述试剂盒包含前述基于荧光raa法检测猪流行性腹泻病毒m基因的组合物。
10、进一步，所述试剂盒还包括阳性对照、阴性对照和/或反应缓冲液。
11、进一步，所述阴性对照为depc水。
12、本专利技术的目的之三在于提供一种基于荧光raa法检测猪流行性腹泻病毒m基因的方法，本专利技术采用病毒核酸释放剂(免核酸提取)替代常规核酸提取过程，结合荧光raa检测技术，特异性检测pedv，操作更简化，同时缩短检测时间。
13、为实现上述目的，本专利技术采用以下技术方案：
14、基于荧光raa法检测猪流行性腹泻病毒m基因的方法，所述方法为非疾病诊疗目的的方法；所述方法包括如下步骤：
15、(1)采用免核酸提取技术处理待测病毒样本，获得样本提取液；
16、(2)以步骤(1)获得的样本提取液为扩增模板，利用前述组合物和/或前述试剂盒进行进行raa扩增反应；
17、(3)根据raa扩增结果判断待测样本中是否含有猪流行性腹泻病毒。
18、进一步，步骤(1)中，将所述待测病毒样本与样品核酸释放剂1:1体积比混合，获得样本提取液；所述样品核酸释放剂为trishcl、nacl、mgcl2、nonidet p-40、rnaseinhibitor和dtt的混合溶液。
19、作为优选，所述病毒核酸释放剂由50～60mm trishcl、120～140mm nacl、1.0～1.5mm mgcl2、0.5％(v/v)nonidet p-40(1.06g/ml)、1000u/ml rnase inhibitor和1mmdtt组成。
20、进一步，所述raa扩增的反应条件为：39℃预热1min；39℃扩增，30s为1个循环并采集荧光信号，共40个循环。
21、进一步，模板浓度在8.86×1010～8.86×100copies/μl范围内，所述方法具有较高的灵敏度。
22、进一步，raa反应的反应温度优选35℃～41℃，反应时间为21min。
23、进一步，所述raa扩增的反应体系为50μl体系，包括：a buffer 25.0μl、上游引物2μl、下游引物2μl、探针0.6μl、depc水12.9μl、标准质粒5μl、b buffer 2.5μl。
24、进一本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.基于荧光RAA法检测猪流行性腹泻病毒M基因的组合物，其特征在于，所述组合物包括上游引物、下游引物和探针；所述上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：13所示；所述下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示；所述探针的核苷酸序列如SEQ ID NO：16所示。
2.根据权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述探针的5’-端采用FITC进行修饰，3’-端采用C3 Spacer进行修饰，中间/THF/间隔及BHQ修饰。
3.基于荧光RAA法检测猪流行性腹泻病毒M基因的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包含权利要求1-2任一项所述的组合物。
4.基于荧光RAA法检测猪流行性腹泻病毒M基因的方法，其特征在于，所述方法为非疾病诊疗目的的方法；所述方法包括如下步骤：
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤(1)中，将所述待测病毒样本与病毒核酸释放剂按1:1体积比混合，获得样本提取液；所述病毒核酸释放剂为TrisHCl、NaCl、MgCl2、Nonidet P-40、RNase inhibitor和DTT的混合溶液。
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7.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，RAA反应的反应温度优选35℃～41℃。
8.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，待测样本包括粪便样本、组织样本、PEDV细胞培养病毒液和/或PEDV疫苗毒株样本。
9.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，结果判定标准如下：在阴性对照无扩增曲线，阳性对照出现扩增曲线的前提下，若无扩增曲线，待测样品为猪流行性腹泻病毒阴性；若出现扩增曲线，待测样品则为猪流行性腹泻病毒阳性。
10.权利要求1-2任一项所述的组合物在制备用于检测猪流行性腹泻病毒M基因的检测试剂或试剂盒中的应用。
...【技术特征摘要】
1.基于荧光raa法检测猪流行性腹泻病毒m基因的组合物，其特征在于，所述组合物包括上游引物、下游引物和探针；所述上游引物的核苷酸序列如seq id no：13所示；所述下游引物的核苷酸序列如seq id no：4所示；所述探针的核苷酸序列如seq id no：16所示。
2.根据权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述探针的5’-端采用fitc进行修饰，3’-端采用c3 spacer进行修饰，中间/thf/间隔及bhq修饰。
3.基于荧光raa法检测猪流行性腹泻病毒m基因的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包含权利要求1-2任一项所述的组合物。
4.基于荧光raa法检测猪流行性腹泻病毒m基因的方法，其特征在于，所述方法为非疾病诊疗目的的方法；所述方法包括如下步骤：
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤(1)中，将所述待测病毒样本与病毒核酸释放剂按1:1体积比混合，获得样本提取液；所述病毒核酸...
【专利技术属性】
技术研发人员：牟豪，杨柳，刘明妮，李绍梅，吕林丹，胡霞，李星，宋振辉，
申请(专利权)人：生猪技术创新中心重庆，
类型：发明
国别省市：
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