【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及的是一种生物工程领域的技术，具体是一种油脂脱臭馏出物(odd)中多环芳烃(pahs)生物降解方法。
技术介绍
1、脱臭馏出物(odd)是天然生育酚的主要来源。目前，多种多环芳烃(pahs)被国际癌症研究署(iarc)归为可能的致癌物。因pahs本身的亲脂性，容易在odd中大量积累；且在odd的下游产品中，也有着较高的pahs污染水平。在pahs的不同脱除方法中，物理吸附并未减少pahs的毒性风险。相较下，生物降解可有效解决该问题，但目前发现单一菌株对于pahs的降解有限，尤其是重质pahs(hpahs)。
技术实现思路
1、本专利技术针对现有技术无法保留天然生育酚成分、无法降解多个苯环的pahs的不足，提出一种油脂脱臭馏出物中多环芳烃生物降解方法，采用双加氧酶基因过表达的大肠杆菌bl21(de3)实现pahs的降解，尤其是hpahs；显著提高脱臭馏出物中多环芳烃的生物降解率且成本低廉，制备简便。
2、本专利技术是通过以下技术方案实现的：
3、本专利技术涉及一种油脂脱臭馏出物中多环芳烃生物降解方法，通过将双加氧酶基因过表达的大肠杆菌bl21(de3)加入含有pahs的脱臭馏出物中，经培养后实现对pahs降解。
4、所述的双加氧酶基因过表达的大肠杆菌bl21(de3)，通过将pdoab-15b质粒和pbrcd质粒共转化于大肠杆菌bl21(de3)后，接种至在补充有氨苄青霉素和庆大霉素的lb培养基中进行培养，再进一步加入异丙基β-d-1-
5、所述的pdoab-15b质粒，通过设计引物对分枝杆菌mycobacterium sp.njs-p中的双加氧酶基因进行pcr扩增，检测目标基因是否存在；再设计引物并用高保真酶primerstarhs(takara)进行pcr从霉菌的基因组dna中获得pdoab基因，纯化并测序，得到pdoab；用peasy-t1 simple cloning kit(transgen)进行ta克隆；进一步设计引物并引入ncoi和bamhi酶切位点，用高保真酶从ta克隆中扩增。用同样的限制性酶处理，与pet15b表达载体进行连接，构建得到双加氧酶表达载体pdoab-15b质粒。
6、所述的分枝杆菌mycobacterium sp.njs-p，具体通过公开渠道(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/ab626849？report＝genbank)得到。
7、所述的pbrcd质粒，其采用但不限于identification of pyrene-inducedproteins in mycobacterium sp.strain 6py1:evidence for two ring-hydroxylatingdioxygenases中记载的技术实现。
8、所述的培养，优选在37℃环境下进行。
9、所述的培养，经37℃得到的培养物在600nm处的吸光度达到0.6。
10、所述的过夜培养，优选在30℃环境下进行。
11、所述的过夜培养，进一步优选将培养得到的产物离心分离得到细胞，洗涤并重悬于补充有氨苄青霉素和庆大霉素的m9-葡萄糖培养基中保存。
12、所述的双加氧酶基因过表达的大肠杆菌bl21(de3)，其用量为每100ml含有pahs的脱臭馏出物中加入大肠杆菌溶液的浓度为1×105cfu/ml。
13、技术效果
14、本专利技术通过诱导实现odd中pahs的生物降解，通过podab、pbrcd共表达的大肠杆菌，能有效脱除odd中的pahs，对odd中pahs的脱除率达42.88％–59.28％，对odd中天然生育酚的保留率在90％以上。有利于odd在高值化利用的同时，降低对人体的危害。
本文档来自技高网...【技术保护点】
1.一种油脂脱臭馏出物中多环芳烃生物降解方法，其特征在于，通过将双加氧酶基因过表达的大肠杆菌BL21(DE3)加入含有PAHs的脱臭馏出物中，经培养后实现对PAHs降解；
2.根据权利要求1所述的油脂脱臭馏出物中多环芳烃生物降解方法，其特征是，所述的PdoAB-15b质粒，通过设计引物对分枝杆菌Mycobacterium sp.NJS-P中的双加氧酶基因进行PCR扩增，检测目标基因是否存在；再设计引物并用高保真酶PrimerSTAR HS(Takara)进行PCR从霉菌的基因组DNA中获得pdoAB基因，纯化并测序，得到pdoAB；用pEASY-T1SimpleCloning Kit(Transgen)进行TA克隆；进一步设计引物并引入NcoI和BamHI酶切位点，用高保真酶从TA克隆中扩增，用同样的限制性酶处理，与pET15b表达载体进行连接，构建得到双加氧酶表达载体PdoAB-15b质粒。
3.根据权利要求1所述的油脂脱臭馏出物中多环芳烃生物降解方法，其特征是，所述的培养，在37℃环境下进行。
4.根据权利要求1所述的油脂脱臭馏出物中多环芳
5.根据权利要求1所述的油脂脱臭馏出物中多环芳烃生物降解方法，其特征是，所述的过夜培养，在30℃环境下进行。
6.根据权利要求1所述的油脂脱臭馏出物中多环芳烃生物降解方法，其特征是，所述的过夜培养，将培养得到的产物离心分离得到细胞，洗涤并重悬于补充有氨苄青霉素和庆大霉素的M9-葡萄糖培养基中保存。
7.根据权利要求1-6中任一所述的油脂脱臭馏出物中多环芳烃生物降解方法，其特征是，所述的双加氧酶基因过表达的大肠杆菌BL21(DE3)，具体通过以下方式得到：在含有氨苄青霉素和庆大霉素的LB培养基中接种菌落；当培养物的吸光度在600nm下达到0.6时，添加0.5mM IPTG(异丙基β-d-1-硫代吡喃半乳糖苷)进行诱导，并在30℃下进一步培养过夜，随后通过离心收获细胞，洗涤并重悬于补充有氨苄青霉素和庆大霉素的100mL M9葡萄糖培养基中，再将25mL细胞液与含有PAHs的5mL脱臭馏出物样品在30℃下培养48小时。
8.根据权利要求1所述的油脂脱臭馏出物中多环芳烃生物降解方法，其特征是，所述的双加氧酶基因过表达的大肠杆菌BL21(DE3)，其用量为每100mL含有PAHs的脱臭馏出物中加入大肠杆菌溶液的浓度为1×105CFU/mL。
...【技术特征摘要】
1.一种油脂脱臭馏出物中多环芳烃生物降解方法，其特征在于，通过将双加氧酶基因过表达的大肠杆菌bl21(de3)加入含有pahs的脱臭馏出物中，经培养后实现对pahs降解；
2.根据权利要求1所述的油脂脱臭馏出物中多环芳烃生物降解方法，其特征是，所述的pdoab-15b质粒，通过设计引物对分枝杆菌mycobacterium sp.njs-p中的双加氧酶基因进行pcr扩增，检测目标基因是否存在；再设计引物并用高保真酶primerstar hs(takara)进行pcr从霉菌的基因组dna中获得pdoab基因，纯化并测序，得到pdoab；用peasy-t1simplecloning kit(transgen)进行ta克隆；进一步设计引物并引入ncoi和bamhi酶切位点，用高保真酶从ta克隆中扩增，用同样的限制性酶处理，与pet15b表达载体进行连接，构建得到双加氧酶表达载体pdoab-15b质粒。
3.根据权利要求1所述的油脂脱臭馏出物中多环芳烃生物降解方法，其特征是，所述的培养，在37℃环境下进行。
4.根据权利要求1所述的油脂脱臭馏出物中多环芳烃生物降解方法，其特征是，所述的培养，经37℃得到的培养物在600nm处的吸光度达到0.6。
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。