【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及软骨素的生物生产领域。
技术介绍
1、软骨素是一种高分子量多糖，天然存在于人和动物的结缔组织中。软骨素属于称为糖胺聚糖的杂多糖家族。
2、糖胺聚糖(gag)或粘多糖是由重复的二糖单元组成的无支链、带负电荷的多糖链，包括酸性糖和氨基糖(n-乙酰葡萄糖胺或n-乙酰半乳糖胺)。由于gag的刚性特性和高负电荷，gag在体内用作润滑剂或减震物。例如，膝关节内衬的软骨基质富含gag，可以通过这种机制支撑数百个大气压的压力。
3、由d-葡萄糖醛酸和n-乙酰-d-半乳糖胺形成的软骨素可以被硫酸化。硫酸软骨素对于维持软骨强度和弹性非常重要，并作为营养补充剂销售，以减轻关节疼痛并促进健康的软骨和关节功能。临床研究支持使用软骨素和硫酸软骨素治疗骨关节炎。
4、硫酸软骨素或软骨素天然存在于皮肤结缔组织的胞外基质中，也用于美容应用，特别是保湿、愈合和舒缓皮肤或作为护发素的组分。
5、目前，软骨素主要通过以下生产：从动物软骨中提取，使用化学和酶促处理将多糖从蛋白质中解离出来并产生不同质量的多糖产物。然而，这些方法可以是既费力又昂贵的。
6、因此，建议微生物生产软骨素。事实上，某些细菌产生软骨素和软骨素样多糖聚合物作为其荚膜的组分。然而，这些已知的细菌，例如多杀巴斯德菌(pasteurellamultocida)或大肠埃希氏菌(escherichia coli)，是许多哺乳动物的病原体并且产生少量的多糖。
7、因此，研究转向重组微生物并且特别是重组细菌，用于生产软骨素。例如
8、与通常用于生产生物分子的其他微生物相反，酵母通常被认为是安全的。与细菌相比，它们可以快速生长并以更高的密度培养，并且不需要无菌环境。此外，酵母细胞比细菌更容易从培养基中分离，大大简化了产品提取和纯化的工艺。最后，酵母具有对培养基中ph变化具有更强耐受性的优势，因此代表了更强的发酵系统。
9、然而，在酵母中，物种之间的区分特征也可带来一定的挑战。这主要是由于物种和其培养条件之间新陈代谢的差异造成的。
10、然而，本专利技术人发现，酿酒酵母作为生产目标分子的工具特别有用，因为它在被人类使用(例如在葡萄酒、啤酒或面包中)方面具有悠久的安全史，因此是一种完善建立的模型，其遗传信息是本领域众所周知的。酿酒酵母还具有被普遍认为对人和动物安全的优势。更重要的是，培养这种酵母时发生的培养基酸化降低了生物发酵罐污染的可能性，因此减少向培养基中添加抗生素的需求。最后，许多遗传工具已被开发出来，允许对其基因组进行稳定修饰(在染色体内整合)。
11、因此，本领域仍然需要允许软骨素高效合成和分泌的另外的软骨素生产方法。特别地，仍然需要提供具有成本效益的生产方法并提供对人应用安全的软骨素。
12、在特别情况下，本领域仍然需要能够获得大量的具有具体且受控尺寸的软骨素的软骨素生产方法。
技术实现思路
1、本专利技术因此涉及以下各项：
2、项1：一种生产软骨素的重组酵母细胞，其中所述重组酵母细胞包含：
3、(a)编码具有软骨素合酶(hcos)活性的多肽的一种或多种重组核酸；和
4、(b)编码具有udp-葡萄糖脱氢酶(udp-glcdh或hasb)活性的多肽的一种或多种重组核酸；和
5、(c)编码具有udp-葡萄糖-4-差向异构酶(kfoa或gne1)活性的多肽的一种或多种重组核酸。
6、如实例中所示，本专利技术的重组酵母允许在天然不能产生该糖胺聚糖的酵母细胞中生产软骨素。实例进一步证明，重组酵母生产的软骨素的大小是可控制的。
7、所述有利特性可以通过将酵母与下文所述的额外修饰重组来进一步增强。
8、项2：根据项1所述的重组，其中所述重组细胞包含编码具有软骨素酶活性的多肽的一种或多种重组核酸，其中所述具有软骨素酶活性的多肽包含分泌信号和任选的锚定信号。
9、项3：一种生产软骨素的重组宿主细胞，其中所述重组宿主细胞包含：
10、(a)编码具有软骨素合酶(hcos)活性的多肽的一种或多种重组核酸；和
11、(b)编码具有udp-葡萄糖脱氢酶(udp-glcdh或hasb)活性的多肽的一种或多种重组核酸；
12、(c)编码具有udp-葡萄糖-4-差向异构酶(kfoa或gne1)活性的多肽的一种或多种重组核酸；和
13、(d)编码具有软骨素酶活性的多肽的一种或多种重组核酸，其中具有软骨素酶活性的多肽包含分泌信号或包含分泌信号和任选的锚定信号，使得软骨素、特别是具有所想要分子量的软骨素由宿主细胞生产。
14、项4：根据项2或3所述的重组宿主细胞，其中所述编码具有软骨素酶活性的多肽的重组核酸获自或源自以下中的至少一者：萨氏九杯蛛(cupiennius salei)、巴西钳蝎(tityus serrulatus)、家牛(bos taurus)、大胡蜂(vespa magnifica)、野捕恒河猴(macaca mulata)或西方蜜蜂(apis mellifera)，并且优选来自巴西钳蝎。
15、项5：根据项2至4中任一项所述的重组细胞，其中所述软骨素的分子量在小于50kda的范围内，优选在约20kda至约50kda的范围内。
16、项6：根据项1至4中任一项所述的重组细胞，其中所述软骨素的分子量在大于50kda的范围内，优选在约50kda至约250kda的范围内。
17、项7：根据项1至4中任一项所述的重组细胞，其中所述软骨素的分子量在大于100kda的范围内，优选在约100kda至约1500kda的范围内。
18、项8：根据项1至7中任一项所述的重组细胞，其中编码具有udp-葡萄糖脱氢酶(udp-glcdh或hasb)活性的多肽的核酸获自或源自以下中的至少一者：拟南芥、小球藻属病毒pbcv1或兽瘟链球菌，并且特别来自拟南芥或小球藻属病毒pbcv1中的至少一者。
19、项9：根据项1至8中任一项所述的重组细胞，其中编码具有软骨素合酶(hcos)活性的多肽的核酸是
20、(i)编码软骨素合酶的核酸；或
21、(ii)编码具有软骨素合酶活性的嵌合多肽的核酸。
22、项10：根据项9所述的重组细胞，其中所述核酸获自或源自多杀巴斯德菌、小球藻属病毒pbcv1、结核分枝杆菌、智人、大肠埃希氏菌、酿酒酵母或草酸青霉(penicilliumoxalicum)中的至少一者。
23、项11：根据项1至10中任一项所述的重组细胞，其中所述编码具有udp-葡萄糖-4-差向异构酶(kfoa或gne1)活性的多肽的核酸获自或源自细菌，并且特别是来自选自由以下组成的组的细菌：铜绿假单胞菌(pseudomonas aeruginosa)、多杀巴斯德菌和大肠埃希氏菌。
<本文档来自技高网...【技术保护点】
1.一种生产软骨素的重组酵母细胞，其中，所述重组酵母细胞包含：
2.根据权利要求1所述的重组细胞，其中，所述重组细胞包含编码具有软骨素酶活性的多肽的一种或多种重组核酸，其中所述具有软骨素酶活性的多肽包含分泌信号和任选的锚定信号。
3.一种生产软骨素的重组宿主细胞，其中，所述重组宿主细胞包含：
4.根据权利要求2或3所述的重组宿主细胞，其中，所述编码具有软骨素酶活性的多肽的重组核酸获自或源自以下中的至少一者：萨氏九杯蛛、巴西钳蝎、家牛、大胡蜂、野捕恒河猴或西方蜜蜂，并且优选来自巴西钳蝎。
5.根据权利要求2至4中任一项所述的重组细胞，其中，所述软骨素的分子量在小于50kDa的范围内，优选在约20kDa至约50kDa的范围内。
6.根据权利要求1至4中任一项所述的重组细胞，其中，所述软骨素的分子量在大于50kDa的范围内，优选在约50kDa至约250kDa的范围内。
7.根据权利要求1至4中任一项所述的重组细胞，其中，所述软骨素的分子量在大于100kDa的范围内，优选在约100kDa至约1500kDa的范围内。<...
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】
1.一种生产软骨素的重组酵母细胞，其中，所述重组酵母细胞包含：
2.根据权利要求1所述的重组细胞，其中，所述重组细胞包含编码具有软骨素酶活性的多肽的一种或多种重组核酸，其中所述具有软骨素酶活性的多肽包含分泌信号和任选的锚定信号。
3.一种生产软骨素的重组宿主细胞，其中，所述重组宿主细胞包含：
4.根据权利要求2或3所述的重组宿主细胞，其中，所述编码具有软骨素酶活性的多肽的重组核酸获自或源自以下中的至少一者：萨氏九杯蛛、巴西钳蝎、家牛、大胡蜂、野捕恒河猴或西方蜜蜂，并且优选来自巴西钳蝎。
5.根据权利要求2至4中任一项所述的重组细胞，其中，所述软骨素的分子量在小于50kda的范围内，优选在约20kda至约50kda的范围内。
6.根据权利要求1至4中任一项所述的重组细胞，其中，所述软骨素的分子量在大于50kda的范围内，优选在约50kda至约250kda的范围内。
7.根据权利要求1至4中任一项所述的重组细胞，其中，所述软骨素的分子量在大于100kda的范围内，优选在约100kda至约1500kda的范围内。
8.根据权利要求1至7中任一项所述的重组细胞，其中，编码具有udp-葡萄糖脱氢酶(udp-glcdh或hasb)活性的多肽的核酸获自或源自以下中的至少一者：拟南芥、小球藻属病毒pbcv1或兽瘟链球菌，并且特别来自拟南芥或小球藻属病毒pbcv1中的至少一者。
9.根据权利要求1至8中任一项所述的重组细胞，其中，所述编码具有软骨素合酶(hcos)活性的多肽的核酸是
10.根据权利要求9所述的重组细胞，其中，所述核酸获自或源自以下中的至少一者：多杀巴斯德菌、小球藻属病毒pbcv1、结核分枝杆菌、智人、大肠埃希氏菌、酿酒酵母或草酸青霉。
11.根据权利要求1至10中任一项所述的重组细胞，其中，所述编码具有udp-葡萄糖-4-差向异构酶(kfoa或gne1)活性的多肽的核酸获自或源自细菌，并且特别是来自选自由以下组成的组的细菌：铜绿假单胞菌、多杀巴斯德菌和大肠埃希氏菌。
12.根据权利要求1至11中任一项所述的重组细胞，其中，所述重组细胞还包含至少一种编码以下中的一者或多者的重组核酸：
13.根据权利要求1至12中任一项所述的重组细胞，其中，所述重组细胞还包含至少一种编码以下中的一者或多者的重组核酸：
14.根据权利要求12或13所述的重组细胞，其中：
15.根据权利要求3至14中任一项所述的重组宿主细胞，其中，所述重组宿主细胞是酵母。
16.根据权利要求1至15中任一项所述的重组细胞，其中，所述重组细胞属于酵母属，或属于念珠菌属，或属于克鲁维酵母菌属，或属于汉逊酵母属，或属于耶氏酵母属，...
【专利技术属性】
技术研发人员：多米尼克·路易斯，卡琳·杰尔拉尔登，缪里·梅尔卡姆，多米尼克·托马斯，
申请(专利权)人：奇华顿股份有限公司，
类型：发明
国别省市：
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