本申请提供了官能化芳基重氮鎓盐和通过电接枝官能化芳基重氮鎓盐而形成的膜。本申请还提供了用于纯化官能化芳基重氮鎓盐的方法和用于用官能化芳基重氮鎓盐涂覆固体支持物系统的方法。这些涂覆的固体支持物系统能够例如用于寡核苷酸合成方法中。
【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本披露提供了通过电接枝官能化芳基重氮鎓盐而形成的膜。还提供了用于利用涂覆有薄膜的电极进行寡核苷酸合成的方法，这些薄膜是通过电接枝官能化芳基重氮鎓盐而形成的。
技术介绍
1、dna微阵列领域的快速发展催生了许多用于合成制备dna的方法。这样的方法包括点样预合成的寡核苷酸、使用掩膜或无掩膜技术的光刻、通过打印试剂的原位合成、以及使用保护性基团的电化学去封闭在电极微阵列上的原位平行合成。寡核苷酸微阵列合成的综述由例如gao等人,biopolymers 2004,73:579提供。1991年报告了使用光掩膜技术合成制备肽阵列。该方法于2000年扩展至包括使用光生酸和/或与光敏剂组合进行去封闭的可寻址掩膜(addressable masking)技术。使用光不稳定去封闭的肽微阵列合成的综述由以下提供：pellois等人,j.comb.chem.2000,2:355以及fodor等人,science,1991,251:767。点样预合成的肽或分离的蛋白质已用于产生肽阵列。蛋白质或肽阵列的综述由以下提供：cahill和nordhoff,adv.biochem.engin/biotechnol.2003,83:177。
2、在cmos(互补金属氧化物半导体)型电极阵列上的电化学平行dna合成已经有了描述(maurer等人,2006,plos one.2006年12月20日；1(1):e34；美国专利号10,525,436)。在此应用中，在dna合成之前，cmos芯片表面每个铂电极上用吸收的多孔反应层涂覆。dna合成起始于多孔层上的羟基。dna合成后，寡聚体留在芯片上，或者寡聚体从芯片表面切割下来。吸收的多孔涂层的一个问题是释放寡聚体的切割时间长。长的切割时间减缓了dna合成产生并且可能影响dna的质量。释放的寡聚体可能仍然具有连接至3'-末端的、吸收的经涂覆分子。dna链的3'-修饰对于一些应用(诸如pcr引物)是一个问题，因为3'-修饰阻断聚合酶延伸。电极上吸收的涂层的另一个问题是在dna合成期间或当用于多种杂交测定时的降解。
3、用苯乙醇基团涂覆金电极以用作dna合成的化学已有了描述(levrie,2018,jpn.j.appl.physics,04fm01，将其通过引用以其全文并入本文)，其中重氮鎓盐由3mm 4-氨基苯基醇(ape-oh)在酸中利用过量的亚硝酸钠“原位”制备获得。
4、类似地，ape-oh重氮鎓(dz)盐沉积在金表面上并且进一步经官能化以制备用于分子印迹的聚合物接枝物(gam-derouich,2010,surf.int.anal.1050)。
5、尽管已经报道了芳基重氮鎓电接枝到铂电极表面上(bernard等人,2003,chem.mater.3450-3462)，但表面涂层没有合适的用于dna合成或使用标准化学偶联方法附接生物分子的官能接头基团。
6、本专利技术通过提供用于利用官能化芳基重氮鎓盐涂覆cmos芯片中的微电极进行寡核苷酸合成的方法来解决这些挑战。
技术实现思路
1、本文提供了用于利用涂覆有薄膜的电极进行寡核苷酸合成的方法和组合物，这些薄膜是通过电接枝官能化芳基重氮鎓盐而形成的。
2、在一个实施例中，使用官能化芳基重氮鎓盐将包含官能团的薄膜(诸如聚醇膜)直接引入电极表面上以起始dna合成。根据此实施例的官能化芳基重氮鎓盐具有下式：
3、y-r-ar-n2+x-，
4、其中：
5、y是官能团；
6、r是任何有机基团或不存在；并且
7、x是无机或有机阴离子。
8、在一些实施例中，ar选自苯基、二甲苯基、萘基、甲苯基和吲哚基。在一些实施例中，ar是苯基。
9、在一些实施例中，y是-oh、-cooh或-nh2。在一些实施例中，y是受保护的。例如，在一些实施例中，y是受保护的-oh、受保护的-cooh或受保护的-nh2。
10、在一些实施例中，r选自烷基、烯基、芳基和杂芳基。在一些实施例中，r选自直链或支链c1-c16烷基、直链或支链c1-c12烷基、直链或支链c1-c8烷基。在一些实施例中，r选自甲基、乙基、异丙基、正丙基、叔丁基、异丁基、正丁基、正戊基、异戊基和1,1-二甲基丙基。
11、在一些实施例中，x是卤素、四氟硼酸根或甲苯磺酸根。
12、在某些实施例中，这些官能化芳基重氮鎓盐选自由以下项组成的组：4-(羟甲基)苯重氮鎓四氟硼酸盐(ab-oh重氮鎓盐)、4-(2-羟乙基)苯重氮鎓四氟硼酸盐(ape-oh重氮鎓盐)和4-羧基苯重氮鎓四氟硼酸盐(ab-酸重氮鎓盐)。
13、在一些实施例中，这些官能化芳基重氮鎓盐是纯化的。
14、在第一个dna合成偶联循环期间，膜表面上暴露的醇残基与活化的(二甲氧基三苯甲基(dmt)保护的)核苷亚磷酰胺反应。在合成期间将膜表面上未反应的醇残基进一步封端，并且进一步组装寡核苷酸链。可以将聚醇涂覆的电极进一步用可切割接头官能化，以允许在合成后释放dna。
15、在一方面，本专利技术提供了纯化的芳基重氮鎓四氟硼酸盐。在一些实施例中，该纯化的芳基重氮鎓四氟硼酸盐选自由以下项组成的组：纯化的4-(羟甲基)苯重氮鎓四氟硼酸盐(ab-oh重氮鎓盐)、纯化的4-(2-羟乙基)苯重氮鎓四氟硼酸盐(ape-oh重氮鎓盐)和纯化的4-羧基苯重氮鎓四氟硼酸盐(ab-酸重氮鎓盐)。
16、在另一方面，本专利技术提供了一种用于制备纯化的芳基重氮鎓四氟硼酸盐的方法，该方法包括：
17、a)将起始苯胺溶解在乙醇中并且添加三氟化硼-thf络合物；
18、b)将所得溶液冷却并且添加亚硝酸叔丁酯；
19、c)将所得溶液温热至室温；以及
20、d)直接或以油状物的形式收集沉淀的盐。
21、在一些实施例中，该方法进一步包括：
22、e)将沉淀的盐用乙醚洗涤。
23、在一方面，本专利技术提供了用于合成寡核苷酸的固体支持物系统，其中该支持物是涂覆有包含官能团的薄膜的电极。在一些实施例中，该薄膜包含羧酸和/或醇官能团。在一些实施例中，该薄膜包含聚醇，优选聚苄醇。在一些实施例中，该薄膜通过电接枝或自发接枝具有下式的官能化芳基重氮鎓盐来形成：
24、y-r-ar-n2+x-，
25、其中：
26、y是官能团；
27、r是任何有机基团或不存在；并且
28、x是无机或有机阴离子。
29、在一些实施例中，该薄膜包括至少两层。在某些实施例中，该薄膜包括松散外部聚醇(例如，聚苄醇)层和稳定内部羟基层。在一些实施例中，可以用浓氢氧化铵去除松散外部聚苄醇(例如，聚苄醇)层。
30、在进一步的实施例中，该固体支持物进一步用长间隔物亚磷酰胺分子和/或可切割接头修饰。在一些实施例中，该间隔物可以是分支胺或聚合物胺，诸如pei或聚-l-赖氨酸。...
【技术保护点】
1.一种纯化的芳基重氮鎓四氟硼酸盐。
2.如权利要求1所述的纯化的芳基重氮鎓四氟硼酸盐，其中所述纯化的芳基重氮鎓四氟硼酸盐选自由以下项组成的组：纯化的4-(羟甲基)苯重氮鎓四氟硼酸盐(AB-OH重氮鎓盐)、纯化的4-(2-羟乙基)苯重氮鎓四氟硼酸盐(APE-OH重氮鎓盐)和纯化的4-羧基苯重氮鎓四氟硼酸盐(AB-酸重氮鎓盐)。
3.一种用于制备纯化的芳基重氮鎓四氟硼酸盐的方法，所述方法包括：
4.如权利要求3所述的方法，所述方法进一步包括：
5.一种通过如权利要求3或4所述的方法获得的纯化的芳基重氮鎓四氟硼酸盐。
6.一种用于合成寡核苷酸的固体支持物系统，其中所述支持物是涂覆有包含官能团的薄膜的电极，其中所述电极是铂电极、钛电极或氮化钛电极。
7.如权利要求6所述的固体支持物系统，其中所述官能团选自由以下项组成的组：羧酸、醇和氨基。
8.如权利要求6或7所述的固体支持物系统，其中所述官能团是受保护的。
9.如权利要求6所述的固体支持物系统，其中所述薄膜包含聚醇，优选聚苄醇。
>10.如权利要求6至9中任一项所述的固体支持物系统，其中所述薄膜通过电接枝或自发接枝具有下式的官能化芳基重氮鎓盐来形成：11.如权利要求10所述的固体支持物，其中：
12.如权利要求10或11所述的固体支持物，其中：
13.如权利要求10至12中任一项所述的固体支持物，其中：
14.如权利要求10至13中任一项所述的固体支持物系统，其中：
15.如权利要求10至14中任一项所述的固体支持物系统，其中所述官能化芳基重氮鎓盐选自由以下项组成的组：4-(羟甲基)苯重氮鎓四氟硼酸盐(AB-OH重氮鎓盐)、4-(2-羟乙基)苯重氮鎓四氟硼酸盐(APE-OH重氮鎓盐)和4-羧基苯重氮鎓四氟硼酸盐(AB-酸重氮鎓盐)。
16.如权利要求6至15中任一项所述的固体支持物系统，其中所述薄膜包括至少两层。
17.如权利要求16所述的固体支持物系统，其中所述薄膜包括松散外部聚醇层和稳定内部羟基层。
18.如权利要求17所述的固体支持物系统，其中所述松散外部聚醇层能够用浓氢氧化铵去除
19.如权利要求17或18所述的固体支持物系统，其中所述聚醇是聚苄醇。
20.如权利要求6至19中任一项所述的固体支持物系统，其中所述固体支持物进一步用长间隔物亚磷酰胺分子和/或可切割接头修饰。
21.如权利要求6至20中任一项所述的固体支持物系统，其中所述固体支持物是电极阵列装置，任选地是使用标准CMOS技术制造的。
22.一种用于合成寡核苷酸的固体支持物系统，其中所述支持物是涂覆有包含聚苄醇的薄膜的电极。
23.如权利要求22所述的固体支持物系统，其中所述薄膜通过电接枝或自发接枝具有下式的官能化芳基重氮鎓盐来形成：
24.如权利要求23所述的固体支持物，其中：
25.如权利要求23或24所述的固体支持物，其中：
26.如权利要求23至25中任一项所述的固体支持物系统，其中：
27.如权利要求23至26中任一项所述的固体支持物系统，其中所述官能化芳基重氮鎓盐是4-(羟甲基)苯重氮鎓四氟硼酸盐(AB-OH重氮鎓盐)。
28.如权利要求22至27中任一项所述的固体支持物系统，其中所述薄膜包括至少两层。
29.如权利要求28所述的固体支持物系统，其中所述薄膜包括松散外部聚苄醇层和稳定内部羟基层。
30.如权利要求29所述的固体支持物系统，其中所述松散外部聚苄醇层能够用浓氢氧化铵去除。
31.如权利要求22至30中任一项所述的固体支持物系统，其中所述固体支持物进一步用长间隔物亚磷酰胺分子和/或可切割接头修饰。
32.如权利要求22至31中任一项所述的固体支持物系统，其中所述固体支持物是电极阵列装置，任选地是使用标准CMOS技术制造的。
33.如权利要求22至32中任一项所述的固体支持物系统，其中所述电极是铂电极、钛电极或氮化钛电极。
34.一种用包含官能团的薄膜涂覆用于合成寡核苷酸的固体支持物系统的方法，所述方法包括将所述固体支持物用包含芳基重氮鎓盐和任选的电解质的溶液处理，以及任选地给所述固体支持物通电，从而产生涂覆的固体支持物。
35.如权利要求34所述的方法，其中所述涂覆的固体支持物进一步与重氮鎓单体基团另外的反应性自由基反应以得到多层膜。
36.如权利要求35所述的方法，其中所...
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】
1.一种纯化的芳基重氮鎓四氟硼酸盐。
2.如权利要求1所述的纯化的芳基重氮鎓四氟硼酸盐，其中所述纯化的芳基重氮鎓四氟硼酸盐选自由以下项组成的组：纯化的4-(羟甲基)苯重氮鎓四氟硼酸盐(ab-oh重氮鎓盐)、纯化的4-(2-羟乙基)苯重氮鎓四氟硼酸盐(ape-oh重氮鎓盐)和纯化的4-羧基苯重氮鎓四氟硼酸盐(ab-酸重氮鎓盐)。
3.一种用于制备纯化的芳基重氮鎓四氟硼酸盐的方法，所述方法包括：
4.如权利要求3所述的方法，所述方法进一步包括：
5.一种通过如权利要求3或4所述的方法获得的纯化的芳基重氮鎓四氟硼酸盐。
6.一种用于合成寡核苷酸的固体支持物系统，其中所述支持物是涂覆有包含官能团的薄膜的电极，其中所述电极是铂电极、钛电极或氮化钛电极。
7.如权利要求6所述的固体支持物系统，其中所述官能团选自由以下项组成的组：羧酸、醇和氨基。
8.如权利要求6或7所述的固体支持物系统，其中所述官能团是受保护的。
9.如权利要求6所述的固体支持物系统，其中所述薄膜包含聚醇，优选聚苄醇。
10.如权利要求6至9中任一项所述的固体支持物系统，其中所述薄膜通过电接枝或自发接枝具有下式的官能化芳基重氮鎓盐来形成：
11.如权利要求10所述的固体支持物，其中：
12.如权利要求10或11所述的固体支持物，其中：
13.如权利要求10至12中任一项所述的固体支持物，其中：
14.如权利要求10至13中任一项所述的固体支持物系统，其中：
15.如权利要求10至14中任一项所述的固体支持物系统，其中所述官能化芳基重氮鎓盐选自由以下项组成的组：4-(羟甲基)苯重氮鎓四氟硼酸盐(ab-oh重氮鎓盐)、4-(2-羟乙基)苯重氮鎓四氟硼酸盐(ape-oh重氮鎓盐)和4-羧基苯重氮鎓四氟硼酸盐(ab-酸重氮鎓盐)。
16.如权利要求6至15中任一项所述的固体支持物系统，其中所述薄膜包括至少两层。
17.如权利要求16所述的固体支持物系统，其中所述薄膜包括松散外部聚醇层和稳定内部羟基层。
18.如权利要求17所述的固体支持物系统，其中所述松散外部聚醇层能够用浓氢氧化铵去除
19.如权利要求17或18所述的固体支持物系统，其中所述聚醇是聚苄醇。
20.如权利要求6至19中任一项所述的固体支持物系统，其中所述固体支持物进一步用长间隔物亚磷酰胺分子和/或可切割接头修饰。
21.如权利要求6至20中任一项所述的固体支持物系统，其中所述固体支持物是电极阵列装置，任选地是使用标准cmos技术制造的。
22.一种用于合成寡核苷酸的固体支持物系统，其中所述支持物是涂覆有包含聚苄醇的薄膜的电极。
23.如权利要求22所述的固体支持物系统，其中所述薄膜通过电接枝或自发接枝具有下式的官能化芳基重氮鎓盐来形成：
24.如权利要求23所述的固体支持物，其中：
25.如权利要求23或24所述的固体支持物，其中：
26.如权利要求23至25中任一项所述的固体支持物系统，其中：
27.如权利要求23至26中任一项所述的固体支持物系统，其中所述官能化芳基重氮鎓盐是4-(羟甲基)苯重氮鎓四氟硼酸盐(ab-oh重氮鎓盐)。
28.如权利要求22至27中任一项所述的固体支持物系统，其中所述薄膜包括至少两层。
29.如权利要求28所述的固体支持物系统，其中所述薄膜包括松散外部聚苄醇层和稳定内部羟基层。
30.如权利要求29所述的固体支持物系统，其中所述松散外部聚苄醇层能够用浓氢氧化铵去除。
31.如权利要求22至30中任一项所述的固体支持物系统，其中所述固体支持物进一步用长间隔物亚磷酰胺分子和/或可切割接头修饰。
32.如权利要求22至31中任一项所述的固体支持物系统，其中所述固体支持物是电极阵列装置，任选地是使用标准cmos技术制造的。
33.如权利要求22至32中任一项所述的固体支持物系统，其中所述电极是铂电极、钛电极或氮化钛电极。
34.一种用包含官能团的薄膜涂覆用于合成寡核苷酸的固体支持物系统的方法，所述方法包括将所述固体支持物用包含芳基重氮鎓盐和任选的电解质的溶液处理，以及任选地给所述固体支持物通电，从而产生涂覆的固体支持物。
35.如权利要求34所述的方法，其中所述涂覆的固体支持物进一步与重氮鎓单体基团另外的反应性自由基反应以得到多层膜。
36.如权利要求35所述的方法，其中所述多层膜包括松散外部聚醇层和稳定内部羟基层。
37.如权利要求36所述的方法，其中所述聚醇是聚苄醇。
38.如权利要求34至37中任一项所述的方法，所述方法进一步包括将涂覆的固体支持物用乙腈洗涤。
39.如权利要求34至38中任一项所述的方法，所述方法进一...
【专利技术属性】
技术研发人员：胡飞驰，M·W·里德，J·库珀，J·凯尔洛克，吴政宪，
申请(专利权)人：金斯瑞美国有限公司，
类型：发明
国别省市：
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