【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种生产姜黄素的重组大肠杆菌及应用，属于基因工程及生物工程。
技术介绍
1、姜黄素类化合物是从姜黄属植物中提取的天然苯丙醇类化合物，具有很多重要的药用价值。姜黄中存在的这类化合物一直被用于传统的亚洲食品和医药领域。姜黄素是一种属于多酚类的天然食品色素。另外，姜黄素具有很好的抗氧化、消炎、抗癌和抗糖尿病潜力，也可用于神经保护剂和抑制人体免疫缺陷病毒的病毒活性。
2、姜黄素主要从植物中提取，但这个过程浪费土地资源、耗时、依赖季节变化。因此，可以考虑采用绿色的、可持续的微生物发酵法生产姜黄素。姜黄素的合成可以分为三个阶段，一是葡萄糖或甘油通过糖酵解途径、磷酸戊糖途径以及莽草酸途径合成酪氨酸，二是酪氨酸经过连续的脱氨、羟基化修饰和甲基化生成阿魏酸酸，三是阿魏酸经过酰化、聚酮并与阿魏酰辅酶a缩合生成姜黄素。目前，已有研究姜黄素的生物合成，但是其产量仍然受到中间产物积累过多、辅因子合成受限、代谢途径不平衡等问题。因此，如何利用生物法合成姜黄素并且获得较高的产量是目前亟需解决的问题。
技术实现思路
1、本专利技术提供了一种合成姜黄素的重组大肠杆菌，对大肠杆菌出发菌株进行了如下至少一种改进：
2、(1)表达来源于大肠杆菌的3-脱氧-d-阿拉伯庚酮糖酸-7-磷酸合成酶突变体arogfbr，来源于拟南芥(arabidopsis thaliana)的对香豆酸辅酶a连接酶at4cl，来源于运动发酵单胞菌(zymomonas.mobilis)的分支酸变位酶zmtyrc；
3、(2)表达来源于约氏黄杆菌(flavobacterium johnsoniae)的酪氨酸解氨酶fjtal，来源于e.coli bl21(de3)内源的4-羟基苯乙酸-3-单加氧酶hpabc，来源于拟南芥(arabidopsis thaliana)的甲氧基转移酶atcomt，来源于皮状丝孢酵母(trichosporoncutaneum)的酪氨酸解氨酶tctal，来源于大肠杆菌的fad合成酶ribf；
4、(3)表达来源于恶臭假单胞菌(pseudomonas putida)外排蛋白srpb；
5、(4)降低脂肪酸代谢调控转录调控因子fadr和/或丙二酰辅酶a还原酶mcrc的表达。
6、在一种实施方式中，所述重组大肠杆菌在seq id no.14所示的cura位点上整合来源于恶臭假单胞菌(pseudomonas putida)外排蛋白srpb。
7、在一种实施方式中，所述二酮辅酶a合酶dcs和姜黄素合酶curs1之间具有柔性连接肽。
8、在一种实施方式中，所述柔性连接肽包括(ggggs)1、(ggggs)3、(eaaak)2、(eaaak)3。
9、在一种实施方式中，所述重组大肠杆菌敲除了seq id no.12所示的脂肪酸代谢调控转录调控因子fadr，增强β氧化途径从而提高丙二酰辅酶a的前体乙酰辅酶a的供给。
10、在一种实施方式中，所述重组大肠杆菌敲除了敲除seq id no.13所示的编码丙二酰辅酶a还原酶mcrc，减少大肠杆菌中丙二酰辅酶a的内源消耗。
11、在一种实施方式中，所述基因fjtal的核苷酸序列如seq id no.1所示。
12、在一种实施方式中，所述基因hpabc的核苷酸序列如seq id no.2所示。
13、在一种实施方式中，所述基因atcomt的核苷酸序列如seq id no.3所示。
14、在一种实施方式中，所述基因cldcs的核苷酸序列如seq id no.4所示。
15、在一种实施方式中，所述基因clcurs1的核苷酸序列如seq id no.5所示。
16、在一种实施方式中，所述基因arogfbr的核苷酸序列如seq id no.6所示。
17、在一种实施方式中，所述基因tctal的核苷酸序列如seq id no.7所示。
18、在一种实施方式中，所述基因ribf的核苷酸序列如seq id no.8所示。
19、在一种实施方式中，所述基因at4cl的核苷酸序列如seq id no.9所示。
20、在一种实施方式中，所述基因zmtyrc的核苷酸序列如seq id no.10所示。
21、在一种实施方式中，所述基因srpb的核苷酸序列如seq id no.11所示。
22、在一种实施方式中，所述基因fadr的核苷酸序列如seq id no.12所示。
23、在一种实施方式中，所述基因mcrc的核苷酸序列如seq id no.13所示。
24、在一种实施方式中，所述基因cura的核苷酸序列如seq id no.14所示。
25、在一种实施方式中，以pcdfduet-1为表达载体，表达tctal和ribf基因。
26、在一种实施方式中，以pacycduet-1为表达载体，表达fjtal、hpabc和atcomt基因。
27、在一种实施方式中，以petduet-1为表达载体，表达arogfbr、zmtyrc、at4cl、cldcs和clcurs1基因。
28、在一种实施方式中，所述重组大肠杆菌以敲除了基因tyrr、ptsg、crr和phea的大肠杆菌bl21(de3)δtyrrδcrrδptsgδphea为宿主；所述基因ptsg、crr和phea分别为葡萄糖特异性磷酸烯醇式丙酮酸磷酸转运系统iibc组分、iia组分和分支酸变位酶的编码基因。
29、本专利技术还提供了一种生产姜黄素的方法，所述方法是利用所述的重组大肠杆菌发酵生产姜黄素。
30、在一种实施方式中，发酵时间≥48h；可选地，发酵48-72h。
31、在一种实施方式中，发酵过程分阶段控制ph。
32、在一种实施方式中，所述分阶段控制ph是控制初始ph为6.4±0.1，培养至对数中期(发酵罐条件下od600≥30)控制ph为5.9±0.1，加入诱导剂诱导20h后，控制ph为5.6±0.1。
33、在一种实施方式中，用于发酵的培养基含有：葡萄糖、甘油、(nh4)2so4、k2hpo4·3h2o、kh2po4、mgso4·7h2o、一水合柠檬酸、维生素b1、酵母提取物。
34、在一种实施方式中，将所述重组大肠杆菌接种至发酵培养基中，在35～37℃下培养至od600为0.5～0.7，加入终浓度为0.1mm的iptg，在28～30℃诱导，从接种至发酵培养基算起发酵至少48h。
35、本专利技术还提供所述重组大肠杆菌或所述方法在生产姜黄素或含姜黄素的产品中的应用。
36、有益效果：
37、本专利技术在大肠杆菌表达了姜黄来源的姜黄素合酶，实现更高产量的姜黄素合成，在此基础上，优本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种合成姜黄素的重组大肠杆菌，其特征在于，对大肠杆菌出发菌株进行了如下至少一种改进：
2.根据权利要求1所述的重组大肠杆菌，其特征在于，所述二酮辅酶A合酶DCS和姜黄素合酶CURS1之间具有柔性连接肽。
3.根据权利要求2所述的重组大肠杆菌，其特征在于，所述柔性连接肽包括(GGGGS)1、(GGGGS)3、(EAAAK)2、(EAAAK)3。
4.根据权利要求1～3任一所述的重组大肠杆菌，其特征在于，所述重组大肠杆菌敲除了脂肪酸代谢调控转录调控因子fadR，和/或敲除了敲除编码丙二酰辅酶A还原酶基因mcrC。
5.根据权利要求1～4任一所述的重组大肠杆菌，其特征在于，以pCDFDuet-1为表达载体，表达TcTAL和RibF基因；以pACYCDuet-1为表达载体，表达FjTAL、HpaBC和AtCOMT基因；以pETDuet-1为表达载体，表达aroGfbr、ZmtyrC、At4CL、ClDCS和ClCURS1基因。
6.根据权利要求1～5任一所述的重组大肠杆菌，其特征在于，以敲除了基因tyrR、ptsG、crr和
7.一种生产姜黄素的方法，其特征在于，利用权利要求1～6任一所述的重组大肠杆菌发酵生产姜黄素。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，用于发酵的培养基含有：葡萄糖、甘油、(NH4)2SO4、K2HPO4·3H2O、KH2PO4、MgSO4·7H2O、一水合柠檬酸、维生素B1、酵母提取物。
9.根据权利要求7或8所述的方法，其特征在于，发酵过程分阶段控制pH。
10.权利要求1～6任一所述的重组大肠杆菌或权利要求7～9任一所述方法在生产姜黄素或含姜黄素的产品中的应用。
...【技术特征摘要】
1.一种合成姜黄素的重组大肠杆菌，其特征在于，对大肠杆菌出发菌株进行了如下至少一种改进：
2.根据权利要求1所述的重组大肠杆菌，其特征在于，所述二酮辅酶a合酶dcs和姜黄素合酶curs1之间具有柔性连接肽。
3.根据权利要求2所述的重组大肠杆菌，其特征在于，所述柔性连接肽包括(ggggs)1、(ggggs)3、(eaaak)2、(eaaak)3。
4.根据权利要求1～3任一所述的重组大肠杆菌，其特征在于，所述重组大肠杆菌敲除了脂肪酸代谢调控转录调控因子fadr，和/或敲除了敲除编码丙二酰辅酶a还原酶基因mcrc。
5.根据权利要求1～4任一所述的重组大肠杆菌，其特征在于，以pcdfduet-1为表达载体，表达tctal和ribf基因；以pacycduet-1为表达载体，表达fjtal、hpabc和atcomt基因；以petduet-1为表达载体...
【专利技术属性】
技术研发人员：周景文，陈建斌，王炼，曾伟主，单小玉，
申请(专利权)人：江南大学，
类型：发明
国别省市：
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