【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生物医药，特别是涉及一种可活化t细胞的盐藻外泌体组合物的制备方法及应用。
技术介绍
1、肿瘤是严重威胁人类健康的恶性疾病之一。根据世界卫生组织(who)估计，全球每年约有1400万新发癌症病例，并且发病人数还在不断攀升，预计2030年新发病例将增加到2100万。癌症的死亡率极高，每年有近千万患者因此丧命。无论在发展中国家还是在发达国家，癌症都是导致死亡最主要的病因之一。传统的抗癌药物通常毒副作用明显，且极易产生耐药性，因此，毒副作用小且不易产生耐药性的肿瘤免疫治疗是近年来肿瘤治疗的一大热点。
2、研究表明，肿瘤微环境(tumormicroenvironment，tme)中的免疫细胞参与了肿瘤发生发展进程，tme是一个高度复杂的生态系统，由肿瘤细胞、免疫细胞以及基质细胞构成。在此复杂的微环境之中，免疫细胞是肿瘤进展的关键参与者，它们的募集和功能受到tme的影响，是决定肿瘤命运及其侵袭和转移能力的基础，通过调控tme来治疗肿瘤是免疫治疗的一个重要方向。肿瘤相关免疫细胞可分为两种类型：抗肿瘤和促肿瘤免疫细胞。两种类型的细胞在肿瘤进展的不同阶段发挥不同作用。其中，细胞毒性t淋巴细胞(ctl)为典型的抗肿瘤免疫细胞，具有识别和消除肿瘤细胞的能力，在抗肿瘤免疫中发挥重要作用。然而，细胞毒性t淋巴细胞(ctl)的活性受限于复杂的肿瘤微环境，例如treg作为能够负性调控免疫性的t细胞，通过控制t细胞活性，降低ctl细胞对肿瘤组织的损伤能力，因此，如何通过提高肿瘤微环境中的ctl细胞的活化效率，进而提高其对肿瘤细胞的杀伤
3、盐藻(dunaliellasalina)，亦称“杜氏藻”。绿藻纲，盐藻科。它是一类极端耐盐的单细胞真核绿藻。盐藻是一种生存在高浓盐湖中的单细胞真核藻类，属浮游生物。是发现的唯一能在高浓度盐水中生存的奇特生命，由于富含独特而丰富的生命元素，被世界科学界誉为“细胞的动力源”，“生命的保护剂”。由于它无细胞壁，是一种天然的原生质体，易于将外源基因导入盐藻，盐藻富含蛋白质，具有蛋白质生产功能，这就为外源基因的表达创造了得天独厚的条件。而外泌体是指包含了复杂rna和蛋白质的小膜泡(30-150nm)，现今，其特指直径在40-100nm的盘状囊泡。其主要来源于细胞内溶酶体微粒内陷形成的多囊泡体，经多囊泡体外膜与细胞膜融合后释放到胞外基质中。所有培养的细胞类型均可分泌外泌体，且外泌体天然存在于体液中，包括血液、唾液、尿液、脑脊液和乳汁中。外泌体广泛参与细胞间的信息交流和物质传递，故盐藻细胞分泌的外泌体是一种绝佳的信息传递载体。而现有技术中并没有利用盐藻细胞外泌体活化t细胞的研究。本专利技术通过使用基因工程技术对廉价的盐藻细胞外泌体进行改造，获得结构独特的外泌体，用来活化胃癌肿瘤微环境中的t细胞。
技术实现思路
1、本专利技术公开了一种可活化t细胞的盐藻外泌体组合物的制备方法及应用，以解决上述现有技术存在的问题，该组合物可以有效活化肿瘤微环境中t细胞，并已证实对肿瘤生长有明显抑制作用。
2、为实现上述目的，本专利技术提供了如下方案：
3、第一方面，本专利技术提供一种可活化t细胞的盐藻外泌体组合物，所述组合物包括抗cd3-m盐藻外泌体和抗cd28-m盐藻外泌体和促进剂；所述抗cd3-m盐藻外泌体含有okt3分子和mesothelin scfv分子(间皮素单链抗体分子)；所述抗cd28-m盐藻外泌体含有cd28 scfv分子和mesothelin scfv分子；所述t细胞是指位于肿瘤微环境中的t细胞。
4、所述mesothelin scfv分子的基因序列参考自文献：the exosomes derived fromcar-tcell efficiently target mesothelin and reduce triple-negative breastcancer growth；cellular immunology；(2021).360,104262；doi：10.1016/j.cellimm.2020.104262.
5、第二方面，本专利技术提供一种上述抗cd3-m盐藻外泌体的制备方法，具体如下：
6、(1)将编码okt3-mesothelin scfv分子的基因导入载体，构建重组质粒；
7、(2)将所述重组质粒导入盐藻细胞中，筛选得到稳定转染且高表达okt3-mesothelin scfv分子的盐藻细胞；
8、(3)步骤(2)筛选得到的盐藻细胞扩大培养后，分离得到外泌体，即为所述抗cd3-m盐藻外泌体。
9、进一步的，步骤(1)中，所述编码okt3-mesothelin scfv分子的基因如seq id no：1所示。
10、本专利技术还提供一种上述抗cd28-m盐藻外泌体的制备方法，具体如下：
11、(1)将编码cd28 scfv-mesothelin scfv分子的基因导入载体，构建重组质粒；
12、(2)将所述重组质粒导入盐藻细胞中，筛选得到稳定转染且高表达cd28scfv-mesothelin scfv分子的盐藻细胞；
13、(3)步骤(2)筛选得到的盐藻细胞扩大培养后，分离得到外泌体，即为所述抗cd28-m盐藻外泌体。
14、进一步的，步骤(1)中，所述编码cd28 scfv-mesothelin scfv分子的基因如seqid no：2所示。
15、t细胞的活化需要双信号，第一信号来自t细胞表面受体tcr识别mhc/抗原肽复合物，传递抗原特异性识别信号；第二信号由apc的共刺激分子提供，为非特异性协同刺激信号。本专利技术中用okt3、cd28 scfv代替了mhc/抗原肽复合物和apc表面共刺激分子，分别与t细胞表面cd3、cd28分子结合，提供t细胞活化的第一，第二信号，t细胞上的cd3分子接触到okt3的刺激信号后，会和t细胞表面的辅助受体cd4或cd8分子的胞浆尾部聚集，进而激活与胞浆尾部相连的酪氨酸激酶，促使cd3分子胞浆的免疫受体酪氨酸活化基序中的酪氨酸磷酸化，磷酸化的酪氨酸进一步磷酸化下游含酪氨酸的蛋白，进而引起激酶活化的级联反应，最终通过激活转录因子，使其进入细胞核内，结合于调控t细胞增殖和活化的靶基因，引起基因的表达和转录，cd28scfv与t淋巴细胞表面的cd28分子结合，提供协同刺激信号，共同促进t细胞由静止状态转为活化状态。
16、间皮素(mesothelin，msln)作为一种肿瘤分化抗原，在正常组织中很少表达，在胃癌细胞中呈过度表达，我们在盐藻细胞外泌体上构建间皮素单链抗体，使得外泌体可以靶向到肿瘤部位，成功结合到胃癌细胞表面的间皮素分子上，同时其携带的okt3和cd28 scfv可以活化肿瘤微环境中的t细胞，盐藻细胞外泌体作为t细胞和肿瘤细胞之间的桥梁，将活化t细胞连接到肿瘤细胞附近，使得t细胞发挥杀伤作用。
17、本专利技术公开了以下技术效果：
本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种可活化T细胞的盐藻外泌体组合物，其特征在于，所述盐藻外泌体组合物包括抗CD3-M盐藻外泌体和抗CD28-M盐藻外泌体；所述抗CD3-M盐藻外泌体含有OKT3分子和间皮素单链抗体分子；所述抗CD28-M盐藻外泌体含有CD28scFv分子和间皮素单链抗体分子。
2.一种制备如权利要求1所述的盐藻外泌体组合物的方法，其特征在于，所述抗CD3-M盐藻外泌体的制备方法为：
3.一种制备如权利要求1所述的盐藻外泌体组合物的方法，其特征在于，所述抗CD28-M盐藻外泌体的制备方法为：
4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，在步骤(1)中，编码OKT3分子和间皮素单链抗体分子基因的核苷酸序列为SEQ ID NO:1。
5.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，在步骤(1)中，编码CD28scFv和间皮素单链抗体分子基因的核苷酸序列为SEQ ID NO:2。
6.根据权利要求1所述的盐藻外泌体组合物，其特征在于，所述抗CD3-M盐藻外泌体和抗CD28-M盐藻外泌体使用比例为1：0.8-1.2。
7.如权利要求1所述
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述盐藻外泌体组合物用量为2.5mg-10mg外泌体/kg小鼠。
...【技术特征摘要】
1.一种可活化t细胞的盐藻外泌体组合物，其特征在于，所述盐藻外泌体组合物包括抗cd3-m盐藻外泌体和抗cd28-m盐藻外泌体；所述抗cd3-m盐藻外泌体含有okt3分子和间皮素单链抗体分子；所述抗cd28-m盐藻外泌体含有cd28scfv分子和间皮素单链抗体分子。
2.一种制备如权利要求1所述的盐藻外泌体组合物的方法，其特征在于，所述抗cd3-m盐藻外泌体的制备方法为：
3.一种制备如权利要求1所述的盐藻外泌体组合物的方法，其特征在于，所述抗cd28-m盐藻外泌体的制备方法为：
4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，在步骤(1)中，编码okt...
【专利技术属性】
技术研发人员：梁高峰，杨如月，冯书营，毛龙飞，何向锋，胡东，安君岭，高社干，
申请(专利权)人：河南科技大学，
类型：发明
国别省市：
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。