【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于分子生物学与细胞，具体涉及il-10蛋白过表达msc细胞株的构建方法及其在治疗骨关节炎疾病的细胞药物中的应用。
技术介绍
1、骨关节炎是一种常见的关节退行性疾病，在发病早期阶段，就已经存在不同严重程度的炎症特性。目前，关于各类炎症和抗炎细胞因子在骨关节炎发病机制中的作用仍在研究中，其中，il-10是一种被认为在骨关节炎发病过程中显示软骨保护作用的细胞因子，已证实il-10参与刺激ii型胶原蛋白和聚集蛋白的合成，在体外条件下给予il-10蛋白后，健康和骨关节炎小鼠的关节软骨中均显示蛋白多糖合成及其在细胞外基质中的百分比增加。
2、基因表达调控技术与人ipsc相结合，可以在多能细胞和随后衍生的特化细胞类型中进行精确的疾病建模与工程改造。
技术实现思路
1、针对从组织来源的天然msc在骨关节炎治疗中存在免疫调节能力有限等问题，本专利技术通过使用crispr系统在ipsc中定点插入外源人il-10基因，然后将ipsc细胞株诱导分化，得到可以过表达il-10蛋白的msc，相比较天然来源的msc，有更好的治疗效果。本专利技术开发了ipsc来源的il-10蛋白过表达msc细胞株，可以高水平表达抗炎因子il-10蛋白，能够更好地保护关节软骨，缓解骨关节炎发病进程，修复关节损伤。
2、为了实现上述目的，本专利技术的其中一个实施例提供了ipsc来源的il-10蛋白过表达msc细胞株的构建方法，其特征在于，使用crispr系统，向细胞中导入含有cas 9蛋白和靶向基
3、如上所述的ipsc来源的il-10蛋白过表达msc细胞株的构建方法，其特征在于，所述基因组安全位点为aavs1安全位点1号内含子中部的位点。
4、如上所述的ipsc来源的il-10蛋白过表达msc细胞株的构建方法，其特征在于，在设计的sgrna序列前端添加caccg序列作为f引物，在sgrna的反向互补序列前端添加aaac序列作为r引物。
5、如上所述的ipsc来源的il-10蛋白过表达msc细胞株的构建方法，其特征在于，crispr基因编辑载体选择获取自addgene的px330，通过常规分子克隆方法将两个bbs ⅰ位点即245位点和267位点之间的序列替换为相应的sgrna序列，获得sgrna载体，载体序列如seq id no：9所示。
6、如上所述的ipsc来源的il-10蛋白过表达msc细胞株的构建方法，其特征在于，所述供体模板质粒主要包括左端同源臂，il-10蛋白表达序列，右端同源臂。
7、如上所述的ipsc来源的il-10蛋白过表达msc细胞株的构建方法，其特征在于，所述il-10蛋白表达序列主要包括启动子，il-10蛋白cds区序列，终止子，所述启动子为cmv启动子序列，所述终止子为bgh poly(a)信号序列。
8、如上所述的ipsc来源的il-10蛋白过表达msc细胞株的构建方法，其特征在于，所述供体模板质粒骨架为获取自addgene的puc57载体，合成左端同源臂，1000bp，合成il-10蛋白插入序列，合成右端同源臂，500bp，通过分子克隆方法将上述三段序列依次插入puc57载体的ecor i位点至hind lll位点之间，获得携带左右同源臂和il-10同源修复模板的供体模板质粒，模板质粒序列如seq id no：10所示。
9、如上所述的ipsc来源的il-10蛋白过表达msc细胞株的构建方法，其特征在于，该诱导分化为体外诱导分化，包含如下步骤：ipsc细胞株的培养、经过诱导形成神经嵴细胞系、神经嵴细胞的扩增培养和储存、神经嵴细胞向msc分化，即得到可以过表达il-10蛋白的msc。
10、如上所述的ipsc来源的il-10蛋白过表达msc细胞株的构建方法，其特征在于，对获得的ipsc细胞进行pcr检测包含：提取各孔细胞基因组dna、进行pcr扩增与测序、挑选具有纯合插入序列的细胞克隆。相应跨同源臂引物序列如seq id no：11至seq id no：16所示。
11、本专利技术的另一个实施例提供了ipsc来源的il-10蛋白过表达msc细胞株的构建方法所获得的msc细胞株在治疗骨关节炎疾病的细胞药物中的应用。
12、本专利技术具有以下优点：
13、1. 本专利技术的细胞株是将外源基因插入人类基因组中已知的安全位点，可以过表达il-10蛋白同时不影响细胞的正常生理功能。
14、2. 本专利技术提供了一种可以高水平表达il-10蛋白的msc，有利于骨关节炎患者的关节保护及损伤修复。
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1.iPSC来源的IL-10蛋白过表达MSC细胞株的构建方法，其特征在于，使用CRISPR系统，向细胞中导入含有Cas 9蛋白和靶向基因组安全位点sgRNA的质粒，以及插入编码IL-10蛋白序列的供体模板质粒，以获得定点插入外源IL-10基因的iPSC细胞株，然后诱导分化iPSC细胞株，获得过表达IL-10蛋白的MSC。
2.根据权利要求1所述的iPSC来源的IL-10蛋白过表达MSC细胞株的构建方法，其特征在于，所述基因组安全位点为AAVS1安全位点1号内含子中部的位点。
3.根据权利要求1所述的iPSC来源的IL-10蛋白过表达MSC细胞株的构建方法，其特征在于，在设计的sgRNA序列前端添加CACCG序列作为F引物，在sgRNA的反向互补序列前端添加AAAC序列作为R引物。
4. 根据权利要求1所述的iPSC来源的IL-10蛋白过表达MSC细胞株的构建方法，其特征在于，CRISPR基因编辑载体选择获取自Addgene的pX330，通过常规分子克隆方法将两个BbsⅠ位点即245位点和267位点之间的序列替换为相应的sgRNA序列，获得sgR
5.根据权利要求1所述的iPSC来源的IL-10蛋白过表达MSC细胞株的构建方法，其特征在于，所述供体模板质粒主要包括左端同源臂，IL-10蛋白表达序列，右端同源臂。
6. 根据权利要求5所述的iPSC来源的IL-10蛋白过表达MSC细胞株的构建方法，其特征在于，所述IL-10蛋白表达序列主要包括启动子，IL-10蛋白CDS区序列，终止子，所述启动子为CMV启动子序列，所述终止子为bGH Poly(A)信号序列。
7. 根据权利要求1所述的iPSC来源的IL-10蛋白过表达MSC细胞株的构建方法，其特征在于，所述供体模板质粒骨架为获取自Addgene的pUC57载体，合成左端同源臂，1000bp，合成IL-10蛋白插入序列，合成右端同源臂，500bp，通过分子克隆方法将上述三段序列依次插入pUC57载体的EcoR I位点至Hind lll位点之间，获得携带左右同源臂和IL-10同源修复模板的供体模板质粒，模板质粒序列如SEQ ID NO：10所示。
8.根据权利要求1所述的iPSC来源的IL-10蛋白过表达MSC细胞株的构建方法，其特征在于，该诱导分化为体外诱导分化，包含如下步骤：iPSC细胞株的培养、经过诱导形成神经嵴细胞系、神经嵴细胞的扩增培养和储存、神经嵴细胞向MSC分化，即得到可以过表达IL-10蛋白的MSC。
9. 根据权利要求1所述的iPSC来源的IL-10蛋白过表达MSC细胞株的构建方法，其特征在于，对获得的iPSC细胞进行PCR检测，包含如下步骤：提取各孔细胞基因组DNA、进行PCR扩增与测序、挑选具有纯合插入序列的细胞克隆，相应跨同源臂引物序列如SEQ ID NO：11至SEQ ID NO：16所示。
10.根据权利要求1至9任意一项所述iPSC来源的IL-10蛋白过表达MSC细胞株的构建方法所获得的MSC细胞株在治疗骨关节炎疾病的细胞药物中的应用。
...【技术特征摘要】
1.ipsc来源的il-10蛋白过表达msc细胞株的构建方法，其特征在于，使用crispr系统，向细胞中导入含有cas 9蛋白和靶向基因组安全位点sgrna的质粒，以及插入编码il-10蛋白序列的供体模板质粒，以获得定点插入外源il-10基因的ipsc细胞株，然后诱导分化ipsc细胞株，获得过表达il-10蛋白的msc。
2.根据权利要求1所述的ipsc来源的il-10蛋白过表达msc细胞株的构建方法，其特征在于，所述基因组安全位点为aavs1安全位点1号内含子中部的位点。
3.根据权利要求1所述的ipsc来源的il-10蛋白过表达msc细胞株的构建方法，其特征在于，在设计的sgrna序列前端添加caccg序列作为f引物，在sgrna的反向互补序列前端添加aaac序列作为r引物。
4. 根据权利要求1所述的ipsc来源的il-10蛋白过表达msc细胞株的构建方法，其特征在于，crispr基因编辑载体选择获取自addgene的px330，通过常规分子克隆方法将两个bbsⅰ位点即245位点和267位点之间的序列替换为相应的sgrna序列，获得sgrna载体，载体序列如seq id no：9所示。
5.根据权利要求1所述的ipsc来源的il-10蛋白过表达msc细胞株的构建方法，其特征在于，所述供体模板质粒主要包括左端同源臂，il-10蛋白表达序列，右端同源臂。
6. 根据权利要求5所述的ipsc来源的il-10蛋白过表达msc细胞株的构建方法，其特征在于，所述il-10蛋白表达序...
【专利技术属性】
技术研发人员：崔生辉，王先流，靳钧，欧阳平，
申请(专利权)人：上海元戊医学技术有限公司，
类型：发明
国别省市：
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