【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于干细胞生物学和机械力学的学科交叉领域，涉及一种在体外高效诱导人多能干细胞向中脑多巴胺能神经前体细胞定向分化的方法。
技术介绍
1、人类多能干细胞，包括人胚胎干细胞和人诱导多能干细胞，是一种拥有自我复制和广泛分化能力的细胞，它们可以转化为身体内几乎所有种类的细胞。这些细胞所具备的独特生物特性和多样的分化能力为其在医学领域赋予了巨大的潜在价值，有望开启一系列创新的治疗策略。例如，通过细胞疗法，人多能干细胞可以被诱导成为各种中脑多巴胺能（mda）神经前体细胞，如：神经细胞、心脏细胞或胰岛细胞等特定细胞，进而应用于治疗如神经退化性疾病、心脏病或糖尿病等。
2、举例来说，帕金森病（parkinson’s disease, pd）是全球最普遍的神经退行性疾病之一，影响超过一千万的人群。该疾病的主要病理特点是中脑黑质的a9型多巴胺神经元大量丧失或损伤，从而导致纹状体内多巴胺的减少，进一步产生pd的典型运动障碍，如震颤、肌肉僵硬、运动迟缓和步态不稳。虽然帕金森病的确切成因尚未明确，但遗传、环境和老化等因素被认为可能与其相关。目前，尽管存在多种治疗pd的方法，如药物治疗、深部脑刺激和物理疗法等，但它们大多只能暂时缓解症状而非治愈疾病。例如，多巴胺药物虽然短期内有效，但长期使用可能引发副作用。深部脑刺激手术的高成本和潜在风险也限制了其应用范围。因此，开发更为有效和安全的治疗策略仍是pd研究的核心目标。
3、pd的细胞治疗策略主要基于将干细胞诱导为mda神经前体细胞，接着将这些细胞植入患者大脑的纹状体。这些细胞在
4、在生物体内，mda神经元的形成是由中脑神经底板细胞分化而来。在神经管的早期形成中，骨形态发生蛋白（bmp）和音猬因子（shh）共同决定了细胞在腹背轴的定位和分化；而wnt、维甲酸、成纤维细胞生长因子8和bmp则共同影响细胞在前后轴的定位。借鉴生物体内mda神经元的发生机制，研究者已经成功地在实验室环境中将人多能干细胞诱导为mda神经细胞。许多研究都已经探讨了如何在体外环境中诱导人多能干细胞向mda神经前体细胞方向分化。目前，一个被广泛采用的策略是：首先使用bmp和转化生长因子-β（tgf-β）的抑制剂，结合shh的激动剂，来推进人多能干细胞向神经底板细胞的方向分化。随后，激活wnt信号，进一步诱导细胞分化为中脑细胞，形成mda神经祖细胞。当得到mda神经祖细胞后，再结合各种神经营养因子（例如脑源性和胶质细胞源性神经营养因子）、wnt信号激活剂、诱导因子tgf-β3、抗坏血酸、环腺苷酸和dapt，进一步推动其向mda神经前体细胞方向分化。但这种方法在转化效率上仍有局限性，尤其是在体内继续分化后，a9型的mda神经元的比例仍需提高。因此，生物医药领域急需一种转化效率高的诱导分化方法来获得中脑多巴胺能神经前体细胞以既有效又安全地应用于临床。
技术实现思路
1、本专利技术提供了一种高效诱导多能干细胞分化为中脑多巴胺能神经前体细胞的方法，可以用于中脑多巴胺能神经前体细胞的高效诱导分化, 能迅速产生大批高纯度的mda神经前体细胞，显著缩短分化时间并提高细胞制品的纯度和产量,本专利技术采取的技术方案是：
2、一种高效诱导多能干细胞分化为中脑多巴胺能神经前体细胞的方法，包含如下步骤：
3、步骤s1，将含有多能干细胞的中脑多巴胺能神经祖细胞诱导培养液铺在软质细胞培养基底上，定向分化培养得到中脑多巴胺能神经祖细胞；
4、步骤s2，将含有该中脑多巴胺能神经祖细胞的中脑多巴胺能神经前体细胞诱导培养液铺在硬质细胞培养基底上，定向分化培养得到该中脑多巴胺能神经前体细胞。
5、进一步地，所述软质细胞培养基底为聚丙烯酰胺凝胶或聚二甲基硅氧烷微柱阵列，等效杨氏模量范围为：0.1~8kpa。
6、进一步地，所述软质细胞培养基底的等效杨氏模量为：5kpa。
7、进一步地，所述硬质细胞培养基底为硼硅酸盐玻璃载玻片或铝硅酸盐玻璃载玻片，等效杨氏模量范围为50~90gpa。
8、进一步地，所述硬质细胞培养基底的等效杨氏模量为：65gpa。
9、进一步地，所述该中脑多巴胺能神经祖细胞诱导培养液包含以下组分：神经细胞基础培养基、n2补充剂、不含维生素a的b27补充剂、浓度为1~5mm的l-谷氨酰胺、浓度为1~15µm的tgf-β信号通路抑制剂、浓度为100~500nm的bmp信号通路抑制剂、浓度为0.5-9µm的gsk-3β抑制剂即wnt信号通路激活剂、音猬因子通路激活剂、浓度为5-15µm的rock抑制剂；所述tgf-β信号通路抑制剂、所述bmp信号通路抑制剂和所述音猬因子通路激活剂在分化第1天至第7天添加到培养液中；所述rock抑制剂只在分化第1天添加到培养液中。
10、进一步地，所述tgf-β抑制剂是sb431542或repsox；所述bmp信号通路抑制剂是ldn193189或dmh-1；所述gsk-3β抑制剂是chir99021或bio；所述rock抑制剂是y27632或blebbistatin。
11、进一步地，所述l-谷氨酰胺浓度为2mm；所述tgf-β抑制剂浓度为10μm；所述bmp信号通路抑制剂的浓度为250nm；所述gsk-3β抑制剂分化第1天至第4天的浓度为0.7μm，分化第5天至第10天的浓度为7.5µm；所述rock抑制剂浓度为10µm。
12、进一步地，该音猬因子通路激活剂为浓度为0.5-2µm 的sag或浓度为100~600ng/ml 的shh蛋白或浓度为1~10µm 的purmorphamine。
13、进一步地，该音猬因子通路激活剂为浓度为1µm 的sag或浓度为500ng/ml 的shh蛋白或浓度为5µm的purmorphamine。
14、进一步地，该中脑多巴胺能神经前体细胞诱导培养液包含以下组分：神经细胞基础培养基、不含维生素a 的b27补充剂、浓度为1~5mm的l-谷氨酰胺、多巴胺能神经祖细胞生长所需的营养因子、l-抗坏血酸、tgf-β3、gsk-3β抑制剂即wnt信号通路激活剂、激活剂camp和dapt；
15、所述多巴胺能神经祖细胞生长所需的营养因子包括脑源性神经营养因子和神经胶质细胞系衍生的神经营养因子；所述脑源性神经营养本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种高效诱导多能干细胞分化为中脑多巴胺能神经前体细胞的方法，其特征在于，包含如下步骤：
2.如权利要求1的一种高效诱导多能干细胞分化为中脑多巴胺能神经前体细胞的方法，其特征在于，所述软质细胞培养基底为聚丙烯酰胺凝胶或聚二甲基硅氧烷微柱阵列，等效杨氏模量范围为：0.1~8kPa。
3.如权利要求2的一种高效诱导多能干细胞分化为中脑多巴胺能神经前体细胞的方法，其特征在于，所述软质细胞培养基底的等效杨氏模量为：5kPa。
4.如权利要求1的一种高效诱导多能干细胞分化为中脑多巴胺能神经前体细胞的方法，其特征在于，所述硬质细胞培养基底为硼硅酸盐玻璃载玻片或铝硅酸盐玻璃载玻片，等效杨氏模量范围为50~90GPa。
5.如权利要求4所述的一种高效诱导多能干细胞分化为中脑多巴胺能神经前体细胞的方法，其特征在于，所述硬质细胞培养基底的等效杨氏模量为：65GPa。
6.如权利要求1所述的一种高效诱导多能干细胞分化为中脑多巴胺能神经前体细胞的方法，其特征在于，所述该中脑多巴胺能神经祖细胞诱导培养液包含以下组分：神经细胞基础培养基、N2补充
7.根据权利要求6所述的一种高效诱导多能干细胞分化为中脑多巴胺能神经前体细胞的方法，其特征在于，所述TGF-β抑制剂是SB431542或RepSox；所述BMP信号通路抑制剂是LDN193189或DMH-1；所述GSK-3β抑制剂是CHIR99021或BIO；所述ROCK抑制剂是Y27632或Blebbistatin。
8.根据权利要求6所述的一种高效诱导多能干细胞分化为中脑多巴胺能神经前体细胞的方法，其特征在于，所述L-谷氨酰胺浓度为2mM；所述TGF-β抑制剂浓度为10μM；所述BMP信号通路抑制剂的浓度为250nM；所述GSK-3β抑制剂分化第1天至第4天的浓度为0.7μM，分化第5天至第10天的浓度为7.5µM；所述ROCK抑制剂浓度为10µM。
9. 根据权利要求6所述的一种高效诱导多能干细胞分化为中脑多巴胺能神经前体细胞的方法，其特征在于，该音猬因子通路激活剂为浓度为0.5-2µM 的SAG或浓度为100~600ng/mL 的SHH蛋白或浓度为1~10µM的Purmorphamine。
10.根据权利要求9所述的一种高效诱导多能干细胞分化为中脑多巴胺能神经前体细胞的方法，其特征在于，该音猬因子通路激活剂为浓度为1µM 的SAG或浓度为500ng/mL 的SHH蛋白或浓度为5µM的Purmorphamine。
11.根据权利要求1所述的一种高效诱导多能干细胞分化为中脑多巴胺能神经前体细胞的方法，其特征在于，该中脑多巴胺能神经前体细胞诱导培养液包含以下组分：神经细胞基础培养基、不含维生素A 的B27补充剂、浓度为1~5mM的L-谷氨酰胺、多巴胺能神经祖细胞生长所需的营养因子、L-抗坏血酸、TGF-β3、GSK-3β抑制剂即WNT信号通路激活剂、激活剂cAMP和DAPT；
12.根据权利要求11所述的一种高效诱导多能干细胞分化为中脑多巴胺能神经前体细胞的方法，其特征在于，该L-谷氨酰胺浓度为2mM；该脑源性神经营养因子的浓度为20ng/mL；该神经胶质细胞系衍生的神经营养因子的浓度为20ng/mL；该L-抗坏血酸的浓度为0.2mM；该TGF-β3的浓度为1ng/mL；该GSK-3β抑制剂即WNT信号通路激活剂浓度为3µM；该激活剂cAMP的浓度为0.5mM；该DAPT的浓度为10µM。
13.根据权利要求1至12任意一项所述的一种高效诱导多能干细胞分化为中脑多巴胺能神经前体细胞的方法，其特征在于，
14.根据权利要求1至12任意一项所述的一种高效诱导多能干细胞分化为中脑多巴胺能神经前体细胞的方法，其特征在于，
...【技术特征摘要】
1.一种高效诱导多能干细胞分化为中脑多巴胺能神经前体细胞的方法，其特征在于，包含如下步骤：
2.如权利要求1的一种高效诱导多能干细胞分化为中脑多巴胺能神经前体细胞的方法，其特征在于，所述软质细胞培养基底为聚丙烯酰胺凝胶或聚二甲基硅氧烷微柱阵列，等效杨氏模量范围为：0.1~8kpa。
3.如权利要求2的一种高效诱导多能干细胞分化为中脑多巴胺能神经前体细胞的方法，其特征在于，所述软质细胞培养基底的等效杨氏模量为：5kpa。
4.如权利要求1的一种高效诱导多能干细胞分化为中脑多巴胺能神经前体细胞的方法，其特征在于，所述硬质细胞培养基底为硼硅酸盐玻璃载玻片或铝硅酸盐玻璃载玻片，等效杨氏模量范围为50~90gpa。
5.如权利要求4所述的一种高效诱导多能干细胞分化为中脑多巴胺能神经前体细胞的方法，其特征在于，所述硬质细胞培养基底的等效杨氏模量为：65gpa。
6.如权利要求1所述的一种高效诱导多能干细胞分化为中脑多巴胺能神经前体细胞的方法，其特征在于，所述该中脑多巴胺能神经祖细胞诱导培养液包含以下组分：神经细胞基础培养基、n2补充剂、不含维生素a的b27补充剂、浓度为1~5mm的l-谷氨酰胺、浓度为1~15µm的tgf-β信号通路抑制剂、浓度为100~500nm的bmp信号通路抑制剂、浓度为0.5-9µm的gsk-3β抑制剂即wnt信号通路激活剂、音猬因子通路激活剂、浓度为5-15µm的rock抑制剂；所述tgf-β信号通路抑制剂、所述bmp信号通路抑制剂和所述音猬因子通路激活剂在分化第1天至第7天添加到培养液中；所述rock抑制剂只在分化第1天添加到培养液中。
7.根据权利要求6所述的一种高效诱导多能干细胞分化为中脑多巴胺能神经前体细胞的方法，其特征在于，所述tgf-β抑制剂是sb431542或repsox；所述bmp信号通路抑制剂是ldn193189或dmh-1；所述gsk-3β抑制剂是chir99021或bio；所述rock抑制剂是y27632或blebbistatin。
8.根据权利要求6所述的一种高效诱导多能干细胞分化为中脑多巴...
【专利技术属性】
技术研发人员：谢天发，靳钧，欧阳平，
申请(专利权)人：上海元戊医学技术有限公司，
类型：发明
国别省市：
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