【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及植物组培，具体涉及一种牛筋条离体快繁方法。
技术介绍
1、随着农业栽培技术的发展，果树产业工作者的追求逐渐由高产量转向高品质，生产方式也逐步向机械化、现代化迈进。矮化密植栽培具有单产高、结果早、作业方便、适合集约化栽培等优点，能够有效弥补传统乔化稀植模式的不足，符合未来果树产业的发展方向。
2、苹果是我国重要的蔷薇科栽培树种，其矮化砧木的选育已取得了重要进展。目前应用比较广泛的主要有英国东茂林试验站通过压条繁育法育成的营养系砧木m系和美国康奈尔大学培育的g系砧木。
3、梨(pyrus l.)是蔷薇科(rosaceae)梨属植物，是世界上重要的温带果树，在我国的栽培面积仅次于苹果和柑橘，具有重要的生产地位。梨从栽培上划分为两大栽培种类群，即西洋梨和东方梨。西洋梨主要以榅桲作为矮化砧木，嫁接成活可以实现矮树冠、早结果、高品质以及耐贮藏等，具有良好的生产效益。东方梨的矮化砧木，目前生产中利用的有国外引进的榅桲以及国内选育的矮化砧木，但仍然缺乏与高产苹果砧木‘m9’相当的梨砧木，没有获得适宜亚洲梨的营养系矮化砧。
4、为解决这一问题，加强东方梨可用育种资源的挖掘、优化育种技术，同时加强致矮机理的研究就显得尤为重要。
5、牛筋条(dichotomanthes tristaniaecarpa)是蔷薇科牛筋条属的植物，常绿灌木至小乔木，高2-4米；枝条丛生，一般生长于山坡开旷地杂木林中以及常绿栎林边缘。早在1978年就有研究证实，牛筋条可作为云南梨的异属砧木，具有良好的矮化和提早坐
6、本课题组通过前期研究筛选出一部分与‘翠冠’梨具有良好亲和性和矮化作用的牛筋条株系，我们希望将筛选获得的牛筋条株系进一步扩繁，探究其与更多东方梨嫁接亲和性及矮化方面的表现，以筛选获得综合性状表现优良的牛筋条无性系，为亚洲梨矮化砧木的选育提供一定参考。目前牛筋条的繁殖方式主要是种籽繁殖和扦插繁殖，但这两种方式存在育种效率低、周期长、成活率低等问题。探究适宜牛筋条的离体快繁体系，可缩短育种周期、提高育种效率，降低成本，为牛筋条的推广应用奠定基础。
技术实现思路
1、本专利技术的目的是提供一种牛筋条离体快繁方法，缩短育种周期、提高育种效率，不仅组培成活率高，而且最大程度保持母株的优良性状。
2、为实现上述目的，本专利技术采用如下技术方案：
3、本专利技术提供了一种牛筋条离体快繁方法，包括以下步骤：
4、(1)以牛筋条幼嫩组织作为外植体，消毒后接种于诱导培养基中进行诱导培养，所述诱导培养基以ms为基本培养基，还包括25～35g/l蔗糖、7～8g/l琼脂、0.5～1.5mg/l 6-苄氨基嘌呤(6-ba)、0.2～0.5mg/lα-萘乙酸(naa)，ph为5.75～5.80；
5、(2)将诱导培养的组培苗接种于增殖培养基中进行增殖培养，所述增殖培养基以ms为基本培养基，还包括25～35g/l蔗糖、7～8g/l琼脂、0.6～0.8mg/l 6-ba、0.3～0.5mg/lnaa，或者还包括25～35g/l蔗糖、7～8g/l琼脂、1.0mg/l 6-ba、0.5mg/l naa、0.01～1.5mg/l赤霉素，ph为5.75～5.80；
6、(3)将增殖培养产生的不定芽分成单芽接种于壮苗培养基中进行壮苗培养，所述壮苗培养基以ms为基本培养基，还包括25～35g/l蔗糖、7～8g/l琼脂、0.1mg/l 6-ba、0.1～0.3mg/l naa，ph为5.75～5.80；
7、(4)将壮苗后的组培苗接种于生根培养基中进行生根培养，得到牛筋条生根苗，所述生根培养基以1/2ms为基本培养基，还包括15～25g/l蔗糖、7～8g/l琼脂、0.3～1.0mg/l3-吲哚丁酸(iba)，ph为5.75～5.80。
8、步骤(1)中，取牛筋条外植体接种于诱导培养基中进行诱导培养。
9、进一步的，步骤(1)中，所述幼嫩组织为牛筋条当年生枝条顶部的嫩叶。
10、进一步的，于春季芽萌动时剪取牛筋条当年生枝条。研究表明，春季芽萌动时采集的材料携带病菌量少，有利于提高外植体的成活率，降低污染率。优选的，于4-5月份采集样品，剪取生长势良好、无病虫害的当年生枝条。
11、进一步的，所述消毒包括将所述外植体经流水冲洗后先用酒精消毒30～45s，无菌水冲洗后置于次氯酸钠溶液中消毒15～20min，最后用无菌水冲洗。每一步消毒处理后用无菌水冲洗3-4次。外植体经上述步骤可快速有效脱毒。所述酒精的体积百分比浓度为75％；所述次氯酸钠溶液体积百分比浓度为2％。次氯酸钠溶液毒害副作用小，本专利技术采用2％次氯酸钠溶液作为消毒剂，相较于0.1％升汞溶液，可以在提高安全指数的情况下实现消毒。
12、进一步的，消毒完成后，吸干外植体表面水分，去除最外层苞片后接种至诱导培养基中进行培养。
13、本专利技术研究表明，外植体诱导培养时，相较于iba，培养基中植物激素采用naa与6-ba组合更有利于保持外植体良好的生长状态，便于进行后续增殖、壮苗及生根。
14、优选的，所述诱导培养基以ms为基本培养基，还包括30g/l蔗糖、7.5g/l琼脂、1.0mg/l 6-ba、0.3mg/l naa，ph为5.75～5.80。
15、诱导培养的条件为温度23～28℃，湿度65～75％，光照时间12～16h/d，光照强度为1500～2000lx，诱导培养30～35天。
16、步骤(2)中，将成功启动培养的外植体分成单个芽，接种于增殖培养基中进行增殖培养。研究表明，增殖培养基中添加0.6～0.8mg/l的6-ba和0.3～0.5mg/l的naa，或者添加1.0mg/l 6-ba、0.5mg/l naa、0.01～1.5mg/l ga3，牛筋条不定芽的增殖系数高，且未见植株出现玻璃化等不利于继续培养的现象。
17、优选的，所述增殖培养基ms为基本培养基，还包括30g/l蔗糖、7.5g/l琼脂、0.8mg/l 6-ba、0.3mg/l naa，或者还包括30g/l蔗糖、7.5g/l琼脂、1.0mg/l 6-ba、0.5mg/l naa、0.01mg/l赤霉素(ga3)，ph为5.75～5.80。
18、增殖培养的条件为温度23～28℃，湿度65～75％，光照时间12～16h/d，光照强度为1500～2000lx，增殖培养45～50天。
19、步骤(3)中，将增殖培养产生的不定芽分成单芽转接至壮苗培养基进行壮苗培养。研究表明，壮苗培养基中添加0.1mg/l的6-ba和0.1～0.3mg/l的naa，植株苗平均株高可达到2-2.5cm，叶色浓绿，叶片较大，生长状况良好，有利于后续培养生长。
20、研本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种牛筋条离体快繁方法，其特征在于，包括以下步骤：
2.如权利要求1所述的牛筋条离体快繁方法，其特征在于，步骤(1)中，所述幼嫩组织为牛筋条当年生枝条顶部的嫩叶，于春季芽萌动时剪取牛筋条当年生枝条。
3.如权利要求1所述的牛筋条离体快繁方法，其特征在于，步骤(1)中，所述消毒包括将所述外植体经流水冲洗后先用酒精消毒30～45s，无菌水冲洗后置于次氯酸钠溶液中消毒15～20min，最后用无菌水冲洗。
4.如权利要求1所述的牛筋条离体快繁方法，其特征在于，步骤(1)中，消毒完成后，吸干外植体表面水分，去除最外层苞片后接种至诱导培养基中进行培养。
5.如权利要求1所述的牛筋条离体快繁方法，其特征在于，步骤(1)-(4)中，培养的条件为温度23～28℃，湿度65～75％，光照时间12～16h/d，光照强度为1500～2000lx。
6.如权利要求1所述的牛筋条离体快繁方法，其特征在于，所述诱导培养基以MS培养基为基本培养基，还包括30g/L蔗糖、7.5g/L琼脂、1.0mg/L 6-苄氨基嘌呤、0.3mg/Lα-萘乙酸，pH
7.如权利要求1所述的牛筋条离体快繁方法，其特征在于，所述增殖培养基MS培养基为基本培养基，还包括30g/L蔗糖、7.5g/L琼脂、0.8mg/L 6-苄氨基嘌呤、0.3mg/Lα-萘乙酸，或者还包括30g/L蔗糖、7.5g/L琼脂、1.0mg/L 6-BA、0.5mg/Lα-萘乙酸、0.01mg/L赤霉素，pH为5.75～5.80；增殖培养45～50天。
8.如权利要求1所述的牛筋条离体快繁方法，其特征在于，所述壮苗培养基以MS培养基为基本培养基，还包括30g/L蔗糖、7.5g/L琼脂、0.1mg/L 6-苄氨基嘌呤、0.1mg/Lα-萘乙酸，pH为5.75～5.80；壮苗培养45～50天。
9.如权利要求1所述的牛筋条离体快繁方法，其特征在于，所述生根培养基以1/2MS作为基本培养基，还包括20g/L蔗糖，7.5g/L琼脂，0.5mg/L IBA，调节pH为5.75～5.80；生根培养30～35天。
10.如权利要求1所述的牛筋条离体快繁方法，其特征在于，步骤(4)中，将株高≥2cm的壮苗接种于生根培养基中。
...【技术特征摘要】
1.一种牛筋条离体快繁方法，其特征在于，包括以下步骤：
2.如权利要求1所述的牛筋条离体快繁方法，其特征在于，步骤(1)中，所述幼嫩组织为牛筋条当年生枝条顶部的嫩叶，于春季芽萌动时剪取牛筋条当年生枝条。
3.如权利要求1所述的牛筋条离体快繁方法，其特征在于，步骤(1)中，所述消毒包括将所述外植体经流水冲洗后先用酒精消毒30～45s，无菌水冲洗后置于次氯酸钠溶液中消毒15～20min，最后用无菌水冲洗。
4.如权利要求1所述的牛筋条离体快繁方法，其特征在于，步骤(1)中，消毒完成后，吸干外植体表面水分，去除最外层苞片后接种至诱导培养基中进行培养。
5.如权利要求1所述的牛筋条离体快繁方法，其特征在于，步骤(1)-(4)中，培养的条件为温度23～28℃，湿度65～75％，光照时间12～16h/d，光照强度为1500～2000lx。
6.如权利要求1所述的牛筋条离体快繁方法，其特征在于，所述诱导培养基以ms培养基为基本培养基，还包括30g/l蔗糖、7.5g/l琼脂、1.0mg/l 6-苄氨基嘌呤、0.3mg/lα-萘乙酸，ph为5.75～5...
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