【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种基于n端编码序列增强l-色氨酸合成的方法，属于基因工程。
技术介绍
1、在期望水平上精确调节基因表达对于代谢工程和合成生物学，尤其是对于微调代谢途径和优化遗传回路具有重要意义。因此，现已通过实验表征或计算设计建立了一系列用于转录，翻译和蛋白质降解水平上控制基因表达的合成或工程化的遗传调控元件，包括启动子、终止子、rbs序列、小调控rna和蛋白质水解标签等。除此之外，n端编码序列通过影响核糖体与mrna结合效率和翻译初始阶段的核糖体延伸，在翻译水平上强烈影响基因表达，这也是微调细菌中内源基因表达的重要机制。
2、l-色氨酸是人类和动物必需的一种芳香族氨基酸，广泛用于动物饲料，食品添加剂和药物的生产中。由于对化石资源枯竭，气候变化及环境可持续制造等需求的日益关注，通过微生物细胞工厂将可再生原料发酵转化为l-色氨酸的方法也变得越来越有吸引力。其中，由于大肠杆菌生长速度快，易于培养，代谢可塑性强及可适用多种遗传和基因工程工具等优势，已被广泛应用于l-色氨酸的生产中。目前，研究人员已尝试了多种代谢工程策略改善l-色氨酸的生产且已取得了较大进步。然而，仅仅通过代谢工程策略仍然难以达到理想产量。并且静态调控也会导致多种问题的出现。如难以平衡细胞生长与产物积累；细胞代谢通量和能量之间的不平衡以及毒性中间产物的积累，从而限制了满足工业需求的生产能力。因此，采用新型合成生物学工具动态调控及优化l-色氨酸的合成已成为一种非常有前景的选择。
技术实现思路
1、技术问题：>
2、本专利技术要解决的技术问题是进一步优化l-色氨酸的合成，提高l-色氨酸的产量。
3、技术方案：
4、为解决上述技术问题，本专利技术通过在l-色氨酸合成关键限速酶trpe的n端插入10个随机氨基酸的核苷酸序列，并与绿色荧光蛋白(gfp)融合以构建trpe-ncs随机突变文库。再结合流式细胞仪进行高通量分选，经初筛和复筛后选取荧光强度最高的突变子进行测序鉴定。最后将鉴定出的最优序列插入至基因trpe的n端实现l-色氨酸产量的提高。
5、本专利技术的第一个目的是提供一种融合蛋白，所述融合蛋白是在l-色氨酸合成关键限速酶trpe的n端连接核苷酸序列如seq id no.1～3任一所示的序列。
6、在本专利技术的一种实施方式中，所述trpe的核苷酸序列如seq id no.5所示。
7、本专利技术的第二个目的是提供一种大肠杆菌工程菌，所述大肠杆菌工程菌表达上述融合蛋白。
8、在本专利技术的一种实施方式中，所述大肠杆菌工程菌整合表达上述融合蛋白。
9、在本专利技术的一种实施方式中，所述大肠杆菌工程菌在ycgh位点整合表达上述融合蛋白。
10、在本专利技术的一种实施方式中，所述大肠杆菌工程菌以大肠杆菌工程菌株trp07为宿主。
11、在本专利技术的一种实施方法中，所述的大肠杆菌工程菌株trp07是通过常压室温等离子体诱变及优化l-色氨酸合成操纵子的表达后得到的菌株，5l发酵罐发酵产l-色氨酸产量为13.79g/l，记载于文献：multidimensional engineering of escherichia coli forefficient synthesis of l-tryptophan，doi:10.1016/j.biortech.2023.129475。
12、在本专利技术的一种实施方法中，所述大肠杆菌工程菌株是anta合酶经过n端序列优化后于5l发酵罐中生产l-色氨酸产量可达16.28g/l。
13、本专利技术的第三个目的是提供一种增强l-色氨酸合成的方法，所述方法为向宿主细胞中引入所述融合蛋白。
14、在本专利技术的一种实施方式中，所述融合蛋白在宿主细胞中整合表达或游离表达。
15、在本专利技术的一种实施方式中，所述整合表达的位点为ycgh位点。
16、在本专利技术的一种实施方式中，所述宿主细胞包括大肠杆菌工程菌株trp07。
17、本专利技术还提供了利用所述大肠杆菌工程菌发酵生产l-色氨酸的方法，将所述大肠杆菌工程菌接种于含有碳源的反应体系中进行l-色氨酸的发酵生产。
18、在本专利技术的一种实施方式中，所述碳源选自葡萄糖、甘油、蔗糖、淀粉或玉米糖浆。
19、在本专利技术的一种实施方式中，所述反应的条件设定为温度37℃，转速为600-700rpm，ph为7.0-7.2。
20、在本专利技术的一种实施方法中，所述反应体系包括20～40g/l葡萄糖、1～5g/l酵母膏、1～5g/l柠檬酸、1～5g/l硫酸铵、5～10g/l磷酸氢二钾、1～2g/l氯化钠、1～2g/l七水硫酸镁、20～40mg/l七水硫酸亚铁、5～15mg/l一水硫酸锰、1～5mg/l vb1、1～5mg/l vh及1～2ml/l的微量元素混合液。
21、在本专利技术的一种实施方式中，所述微量元素混合液包括二水氯化钙5～15g/l，二水硫酸铜0.5～1g/l，六水氯化钴1～5g/l，二水硫酸锌5～10g/l。
22、本专利技术还提供了所述融合蛋白或所述大肠杆菌工程菌株或所述方法在生产l-色氨酸或含有l-色氨酸的产品中的应用。
23、有益效果：
24、本专利技术提供了一种基于n端编码序列优化增强l-色氨酸合成的方法，通过在l-色氨酸合成关键限速酶trpe的n端插入10个随机氨基酸的核苷酸序列，并与绿色荧光蛋白(gfp)融合以构建trpe-ncs随机突变文库。结合流式细胞仪初筛和孔板复筛后得到的表达强度最高的ncs序列比对照菌株约高出6.2倍。最后，将筛选得到的核苷酸序列如seq idno.1所示的ncs序列插入到基因trpe的n端，构建得到的工程菌株trp08的l-色氨酸产量在5l发酵罐中可达16.28g/l，约比对照菌株提高18.06％。
本文档来自技高网...【技术保护点】
1.一种融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白是在L-色氨酸合成关键限速酶TrpE的N端连接核苷酸序列如SEQ ID NO.1～3任一所示的序列，所述TrpE的核苷酸序列如SEQ IDNO.5所示。
2.一种大肠杆菌工程菌，其特征在于，表达权利要求1所述融合蛋白。
3.根据权利要求2所述的大肠杆菌工程菌，其特征在于，所述大肠杆菌工程菌整合表达权利要求1所述融合蛋白。
4.根据权利要求3所述的大肠杆菌工程菌，其特征在于，在ycgH位点整合表达权利要求1所述融合蛋白。
5.根据权利要求2～4任一所述的大肠杆菌工程菌，其特征在于，所述大肠杆菌工程菌以大肠杆菌工程菌株TRP07为宿主。
6.一种增强L-色氨酸合成的方法，其特征在于，所述方法为向宿主细胞中引入权利要求1所述融合蛋白。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述融合蛋白在宿主细胞中整合表达或游离表达。
8.根据权利要求6或7所述的方法，其特征在于，所述宿主细胞包括大肠杆菌工程菌株TRP07。
9.一种发酵生产L-色氨酸的方法，其特
10.权利要求1所述融合蛋白，或权利要求2～4任一所述所述大肠杆菌工程菌株，或权利要求9所述方法在生产L-色氨酸或含有L-色氨酸的产品中的应用。
...【技术特征摘要】
1.一种融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白是在l-色氨酸合成关键限速酶trpe的n端连接核苷酸序列如seq id no.1～3任一所示的序列，所述trpe的核苷酸序列如seq idno.5所示。
2.一种大肠杆菌工程菌，其特征在于，表达权利要求1所述融合蛋白。
3.根据权利要求2所述的大肠杆菌工程菌，其特征在于，所述大肠杆菌工程菌整合表达权利要求1所述融合蛋白。
4.根据权利要求3所述的大肠杆菌工程菌，其特征在于，在ycgh位点整合表达权利要求1所述融合蛋白。
5.根据权利要求2～4任一所述的大肠杆菌工程菌，其特征在于，所述大肠杆菌工程菌以大肠杆菌工程菌株trp07为宿主...
【专利技术属性】
技术研发人员：饶志明，唐蜜，潘学玮，杨田金，孙启盛，徐美娟，杨套伟，张显，
申请(专利权)人：江南大学，
类型：发明
国别省市：
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。