【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生物农药领域，涉及一种用于害虫生物防治的双链rna及其应用。
技术介绍
1、rna干扰(rna interference,rnai)技术是一种用于害虫防控的新技术，利用害虫体内自身的rna调控机制，将目标基因以双链rna的形式送入体内，引起基因沉默，导致害虫死亡。该技术绿色环保且简单便捷，在如今化学农药环境污染严重、抗药性增加、残留问题无法解决的大环境下，成为了极佳的替代品。
2、随着昆虫的对化学农药的解毒能力的逐步加强、对杀虫剂靶标位点的敏感度逐步下降，对rna干扰技术的机理研究愈发透彻、在转基因植物培养、疾病防治等的运用愈发成熟，人们开始将rna干扰技术也运用到虫害防治中。研究人员不停地探寻合高效的目的基因、更好的双链rna的导入方式、合适的双链rna的使用频率等来提高rna干扰的沉默效果，已在实验室条件下将rna干扰技术成功应用于双翅目、鞘翅目、鳞翅目、膜翅目、半翅目和直翅目等多种类型的害虫中，rna干扰已经在害虫防治方面表现出巨大的潜力。
3、rna干扰目的基因的筛选一般从以下几个方面着手，包括直接致死基因、与害虫产卵或交配有关的基因影响像卵黄原蛋白受体(vitellogenin recepotor,vgr)、与害虫生长发育有关的基因诸如保幼激素与蜕皮激素、与害虫抗性和免疫相关的基因可降低害虫对长期农药使用而产生的抗药性、功能性基因如与嗅觉相关的基因以干扰害虫对作物的识别等。
4、在yojana等人(yojana r.chikate,vishal v.dawkar,ran
5、作为生物体内一种必不可缺的酯酶——乙酰胆碱酯酶(acetylcholinestrase，ache)，其最主要也是最基础的作用就是将乙酰胆碱(acetycholine，ach)水解为乙酸和胆碱，以此来保证神经信号可以正常的传递，防止乙酰胆碱在神经突触间隙积累过剩而导致的神经抽搐、痉挛最终死亡。换句话说，乙酰胆碱酯酶只要失活或者活性被抑制就可以起到使昆虫的神经系统被扰乱，导致昆虫神经系统长期处于兴奋状态，从而影响昆虫其他生理活动和繁殖生存的作用。因此，乙酰胆碱酯酶基因属于直接致死基因。
6、自1914年乙酰胆碱的理论被提出到1932年被分离并鉴定，关于乙酰胆碱酯酶的研究一直在不停地深入，人们发现乙酰胆碱酯酶的功能不仅限于基础的催化作用，它能影响细胞的粘附作用，譬如在骨细胞中能与骨细胞基质发生作用；在神经细胞中也与细胞粘附有一定关系，促进轴突生长、诱导突触形成、参与神经细胞的迁移活动等。除此之外，乙酰胆碱酯酶也能促进血小板生成解决干细胞移植后血小板减少的问题、作为细胞凋亡的标志物促进细胞的凋亡、影响淀粉样蛋白代谢与聚集、调节多巴胺-胆碱能神经活性、关系大鼠的学习与记忆功能等等。总之，乙酰胆碱酯酶与乙酰胆碱酯酶抑制剂已经逐步脱离理论被广泛应用于医药、农业学、生物研究等各个领域。
7、在无脊椎动物中，胆碱只能被乙酰胆碱酯酶水解，因而，乙酰胆碱酯酶的作用在无脊椎动物中更重要，其种类也会相较于脊椎动物更复杂更多样。编码乙酰胆碱酯酶的基因被称为ace基因，大多只有2种，分别为ace 1和ace 2。
8、危害农作物的鳞翅目害虫繁多，常见的有棉铃虫helicoverpa armigera、小菜蛾plutella xylostella、甜菜夜蛾spodoptera exigua、斜纹夜蛾spodoptera liturafabricius、草地贪夜蛾spodoptera frugiperda等，均是危害蔬菜最严重的鳞翅目昆虫，其中：
9、棉铃虫主要为害卷心菜、玉米、番茄等作物，它们在不同温度下产卵量差异很大，最高可产卵900多枚，虫卵在2至4天孵化为幼虫，幼虫长4mm，成虫长15～18mm，翅宽32～35mm，前翅有不规则的黑点和浅灰色波浪线，后翅颜色呈白色。在适宜温度下，一个完整的世代需要31～36天，一个季节发生少则3代，多则8代，2龄后即可蚕食叶片，造成蔬菜减产；
10、小菜蛾别名小青虫，幼虫多为深褐色，体长在9～12mm，头部呈黄褐色，前胸背板上可见花纹，其蛹为黄绿色或灰褐色，体长7～9mm，被丝茧裹盖。此虫在干旱温热的条件下为害最严重，一年发生少则5代，多则18代，小菜蛾适应力和抗药性较强，是目前报告的20种最具抗性的害虫物种之一，已对常用的有机磷和菊脂类农药产生较高抗性，药剂可选择范围小；
11、甜菜夜蛾，又称玉米夜蛾，属鳞翅目夜蛾科，是一种很难防治的鳞翅目害虫，为害多种蔬菜，如大豆、白菜、赤豆、茄子、马铃薯等。甜菜夜蛾卵期为2～5天，成虫体长11～14mm，翅宽23～28mm,前翅有三角形黑斑，该类虫一般呈灰褐色，在长到3～4龄幼虫时大量取食作物，严重时可将叶片全部食尽，适合生长条件下可一年发生5～8代；
12、棉铃虫helicoverpa armigera、小菜蛾plutella xylostella和甜菜夜蛾spodoptera exigua均为鳞翅目害虫，对我国农业作物的生长造成巨大的影响和伤害，十分影响农产品的质量和产量，对国家的经济、环境以及粮食需求都产生了直接的危害。因此，将以这三种害虫作为主要研究对象，运用rna干扰技术只识别对应的mrna序列，不对非靶向生物造成伤害的特点，研究对人体、环境无害又能防治害虫的生物农药，从而为开发新型rna干扰药剂提供一些实验室理论依据作为参考。
13、近年来全球极端气候高频出现，旱涝洪涝时常发生，人类活动加剧等一系列原因造成严重的生态环境破坏，害虫种群数量为此大幅度上涨，虫灾虫害发生频率也随之增加，这对全球农业经济造成巨大损失，为此，害虫防治成为农业发展重心。现目前常见的害虫防治手段主要有农业防治、物理防治、化学防治和生物防治。
14、rna干扰的现象自1998年被发现至今已在多种生物中已被发现，并证实高度保守。然而目前，关于鳞翅目的rna干扰反应的相关研究在相关文献中比较少的进行实验，而且多为体外直接合成双链rna，但是体外合成的双链rna在环境中不稳定(光照、温度也会使体外合成的rna失活)、害虫食用后在体内易分解本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种引起害虫AChE基因沉默的RNA，其为棉铃虫引物对，或棉铃虫引物对与小菜蛾引物对、甜菜夜蛾引物对中的一种或两种组合，其中：
2.一种表达RNA的工程菌，其特征在于，所述原料为：权利要求1所述的RNA、载体和感受态细胞。
3.根据权利要求2所述的工程菌，其特征在于，所述载体为T Easy载体；所述感受态细胞是大肠杆菌。
4.一种权利要求2或3所述的工程菌的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
5.一种工程菌生产的双链RNA，其特征在于，由以下方法的诱导表达：权利要求2或3所述的工程菌在IPTG的诱导下，生成双链RNA。
6.根据权利要求5所述的双链RNA，其特征在于，所述诱导表达方法，包括以下步骤：挑取单菌落置于含氨苄青霉素LB液体培养基溶液中培养过夜，取过夜培养菌液到含氨苄青霉素的抗性2×YT培养基溶液中，摇床培养，至OD600＞0.8，加入IPTG溶液，继续摇床培养，得到双链RNA，将其离心，弃去上清，将菌泥干燥，即得。
7.一种含双链RNA的可湿性粉剂，包括：权利要求5所述的双链RNA、载体、表面
8.根据权利要求7所述的可湿性粉剂，其特征在于，所述可湿性粉剂包括以下质量份的成分：双链RNA 10份、载体30-150份、表面活性剂2-9份和RNA酶抑制剂2-9份；
9.根据权利要求7所述的可湿性粉剂，其特征在于，所述表面活性剂为十二烷基硫酸钠、拉开粉、木质素磺酸钠或木质素磺酸钙，优选为木质素磺酸钙；
10.权利要求7-9任一项所述的可湿性粉剂在制备用于预防和控制鳞翅目害虫的农药中的应用。
...【技术特征摘要】
1.一种引起害虫ache基因沉默的rna，其为棉铃虫引物对，或棉铃虫引物对与小菜蛾引物对、甜菜夜蛾引物对中的一种或两种组合，其中：
2.一种表达rna的工程菌，其特征在于，所述原料为：权利要求1所述的rna、载体和感受态细胞。
3.根据权利要求2所述的工程菌，其特征在于，所述载体为t easy载体；所述感受态细胞是大肠杆菌。
4.一种权利要求2或3所述的工程菌的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
5.一种工程菌生产的双链rna，其特征在于，由以下方法的诱导表达：权利要求2或3所述的工程菌在iptg的诱导下，生成双链rna。
6.根据权利要求5所述的双链rna，其特征在于，所述诱导表达方法，包括以下步骤：挑取单菌落置于含氨苄青霉素lb液体培养基溶液中培养过夜...
【专利技术属性】
技术研发人员：开振鹏，凌烨，贾柳萌，丁丞，陈珊珊，
申请(专利权)人：天育湖州生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：
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