【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于蛋白质组学领域，具体涉及一种基于胞内原位交联的顺铂-dna损伤应答蛋白质组学检测方法。
技术介绍
1、顺铂是临床上使用最为广泛的抗癌药物之一。虽然顺铂的早期治疗非常有效，但易产生获得性耐药以及毒副作用限制了其长期疗效。为了改善顺铂的治疗效果，国内外科学家对其分子作用机理进行着持续不断的探索。顺铂是一种基因毒性药物，其最终作用靶标为细胞核内的dna。它能与dna上的碱基发生共价结合，形成单功能加合物、链内和链间交联产物，从而阻碍dna复制和转录，最终诱导细胞死亡。损伤dna是顺铂发挥抗癌活性的关键途径。当细胞内dna受损后，损伤感应相关蛋白会识别损伤，并激活相应信号转导通路，使细胞周期阻滞。随后，dna修复蛋白会尝试修复损伤，如果修复失败，细胞会启动凋亡程序；如果修复成功，细胞会重新进入细胞周期，继续存活。因此，dna损伤应答是细胞响应顺铂的基因毒性，并决定细胞命运的关键环节。
2、dna损伤应答由大量dna结合蛋白来完成。如上所述，顺铂能与dna形成复合物，从而对dna造成多种影响。首先，顺铂对碱基的共价修饰会在dna链上产生物理障碍，阻碍dna/rna聚合酶的延伸；其次，顺铂的结合会使双链dna结构发生解旋和扭曲，产生构象变化；另外，顺铂本身带正电荷，与dna结合后会中和掉一些dna的负电性。顺铂对dna结构和电荷状态的改变，将直接影响dna与蛋白质的结合。一方面，顺铂损伤位点会招募特异性识别蛋白，使得这些蛋白的dna亲和力增强；另一方面，也会导致一些蛋白从dna上解离下来，对dna的亲和力下降。这些
3、目前，顺铂-dna损伤应答蛋白主要是通过体外亲和纯化来发现的。即在体外合成顺铂-dna/寡核苷酸复合物模型，再修饰到固相材料表面，以此构建亲和探针，与细胞的蛋白提取液孵育，捕获顺铂-dna损伤应答蛋白(du et al.,j.am.chem.soc.2014,136(8):2948-2951；he et al.,chem.sci.2015,6(3):2074-2078；zeng et al.,anal.chem.2019,91(9):6035-6042；yuan et al.,metallomics 2020,12(11):1834-1840.)。这种体外实验可以精确构建顺铂结合dna的位点和模式，方便研究特定dna损伤形式的识别蛋白。基于此方法，已发现许多重要的识别蛋白。然而，细胞内部的生物过程远比体外分子亲和结合复杂。亲和纯化所用的dna模型在结构和序列多样性上也不及细胞内基因组dna。而且，蛋白提取液缺失了细胞内部分子分布的空间信息，仅基于分子间相互作用和识别，容易造成假阳性结果。另外，因为是基于非共价作用，在亲和捕获以及后续样品处理过程中可能会丢失一些弱相互作用和瞬时相互作用，产生假阴性结果。因此，现有的顺铂-dna损伤应答蛋白的研究方法不能够满足本领域研究者的需求，人们仍然希望开发出新的顺铂-dna损伤应答蛋白的检测方法，能够准确获取和鉴定细胞内的顺铂-dna损伤应答蛋白，从而确证既往研究结果，发现新的应答蛋白，更真实全面地探究顺铂的作用机制。
4、近年来，交联技术被广泛应用于研究生物大分子的相互作用。常用交联方法有化学交联、光亲和交联和紫外光交联。针对顺铂-dna损伤应答蛋白的研究，交联方法应满足几个基本条件：1)能迅速固定细胞内的生物过程，本身不影响细胞的生命活动；2)不改变顺铂的作用行为；3)选择性交联相互作用的分子。光亲和交联需要在目标分子上修饰光亲和基团，可能改变顺铂的化学性质；而紫外光交联需要使用高强度的激光，本身会造成细胞内dna损伤，且对设备要求很高，二者均不是获取细胞内顺铂-dna损伤应答蛋白的优选方法。因此，使用化学交联来实现胞内原位交联dna和应答蛋白更具有可行性。常用交联试剂有二(磺基琥珀酰亚胺)辛二酸酯、双琥珀酰亚胺辛二酸酯和双琥珀酰亚胺戊二酸酯等，它们的细胞渗透能力较弱，常用于体外溶液内分子的交联，且其更倾向于蛋白之间的氨基交联反应，对dna-蛋白质的交联效率较低。因此，它们都不适用于胞内原位交联dna和应答蛋白。
5、不同的生物大分子间作用强弱不同，因此针对特定的研究体系，需要选择合适的交联分子和交联条件才能够更好地捕捉弱相互作用和瞬时相互作用，实现结合强度恰当的交联作用，从而对实现对相关生物大分子的高灵敏度和准确性的检测。目前，现有技术中尚未开发出合适的化学交联体系，实现对顺铂-dna损伤应答蛋白的检测，这仍然是本领域亟需解决的问题。
技术实现思路
1、针对现有技术的问题，本专利技术提供一种基于胞内原位交联的顺铂-dna损伤应答蛋白质组学检测方法，通过优选交联试剂和交联条件，实现对顺铂-dna损伤应答蛋白的高灵敏度和高准确性的检测。
2、一种基于胞内原位交联的顺铂-dna损伤应答蛋白质组学检测方法，包括如下步骤：
3、步骤1，采用顺铂处理待研究细胞；
4、步骤2，将步骤1处理后的待研究细胞进行洗涤，加入甲醛进行交联；
5、步骤3，将步骤2处理后的待研究细胞进行裂解，离心分离得到dna-蛋白质复合物；
6、步骤4，超声打断所述dna-蛋白质复合物中的dna，解交联得到蛋白溶液；
7、步骤5，检测所述蛋白溶液中蛋白质的种类和/或含量。
8、优选的，步骤2中，所述交联的时间为20-30min。
9、优选的，步骤2具体包括如下步骤：
10、步骤2.1，吸去所述待研究细胞的培养基，将所述待研究细胞用pbs洗涤；
11、步骤2.2，向所述待研究细胞中加入甲醛，孵育；
12、步骤2.3，猝灭甲醛后移除反应液，用pbs洗涤。
13、优选的，步骤2.2中，所述甲醛为质量分数0.5-1％的甲醛pbs溶液。
14、优选的，步骤2.3中，采用甘氨酸溶液猝灭甲醛。
15、优选的，步骤3具体包括如下步骤：
16、步骤3.1，采用sds水溶液对所述待研究细胞进行裂解；
17、步骤3.2，加入尿素溶液，分离沉淀；
18、步骤3.3，分散步骤3.2得到的沉淀，加入rnase a，酶切rna，再次分离沉淀，洗涤沉淀，得到dna-蛋白质复合物。
19、优选的，步骤4中，将所述dna-蛋白质复合物分散在含体积分数10％甘油的tris溶液中后进行超声打断。
20、优选的，步骤4中，所述超声打断的时间为15-20min。
21、优选的，步骤4中，解交联的条件为65-95℃孵育0.5-2h。
22、优选的，所述待研究细胞为癌细胞。
23、本专利技术采用甲醛交联dna和dna损伤应答蛋白，甲醛具有很强的细胞渗透能力和化学反应活性，能迅速地与胞内生物大分子上的氨基反应，将空间距离足够近的蛋白-蛋白本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种基于胞内原位交联的顺铂-DNA损伤应答蛋白质组学检测方法，其特征在于，包括如下步骤：
2.按照权利要求1所述的检测方法，其特征在于：步骤2中，所述交联的时间为20-30min。
3.按照权利要求1所述的检测方法，其特征在于：步骤2具体包括如下步骤：
4.按照权利要求3所述的检测方法，其特征在于：步骤2.2中，所述甲醛为质量分数0.5-1％的甲醛PBS溶液。
5.按照权利要求3所述的检测方法，其特征在于：步骤2.3中，采用甘氨酸溶液猝灭甲醛。
6.按照权利要求1所述的检测方法，其特征在于：步骤3具体包括如下步骤：
7.按照权利要求1所述的检测方法，其特征在于：步骤4中，将所述DNA-蛋白质复合物分散在含体积分数10％甘油的Tris溶液中后进行超声打断。
8.按照权利要求1所述的检测方法，其特征在于：步骤4中，所述超声打断的时间为15-20min。
9.按照权利要求1所述的检测方法，其特征在于：步骤4中，解交联的条件为65-95℃孵育0.5-2h。
10.按照权利要求1
...【技术特征摘要】
1.一种基于胞内原位交联的顺铂-dna损伤应答蛋白质组学检测方法，其特征在于，包括如下步骤：
2.按照权利要求1所述的检测方法，其特征在于：步骤2中，所述交联的时间为20-30min。
3.按照权利要求1所述的检测方法，其特征在于：步骤2具体包括如下步骤：
4.按照权利要求3所述的检测方法，其特征在于：步骤2.2中，所述甲醛为质量分数0.5-1％的甲醛pbs溶液。
5.按照权利要求3所述的检测方法，其特征在于：步骤2.3中，采用甘氨酸溶液猝灭甲醛。
6.按照权...
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