【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及基因工程，具体地说，涉及一种产赖氨酸的重组微生物及其构建方法与应用。
技术介绍
1、谷氨酸棒杆菌(corynebacterium glutamicum)是革兰氏阳性微生物，具有生长速度快、非致病、对自身代谢物降解能力弱的特性。作为传统工业微生物，谷氨酸棒杆菌广泛用于生产多种氨基酸、核苷酸及其他有机酸。
2、谷氨酸棒杆菌用于生产氨基酸的历史可追溯到20世纪60年代，谷氨酸棒杆菌可以在自然环境下生产谷氨酸，诱变的谷氨酸棒杆菌还可以生产赖氨酸、缬氨酸等多种氨基酸。随着代谢工程技术和基因组测序技术的快速发展，对谷氨酸棒杆菌的代谢路径研究越来越清晰，研究者们陆续鉴定到很多遗传学上的高产机理，并实现了多种代谢产物的高效生产。
3、l-赖氨酸是碱性必需氨基酸，分子式为c6h14n2o2，外观为白色或近乎于白色结晶粉末。l-赖氨酸在210℃变暗，在224.5℃下分解，易溶于水，微溶于醇，不溶于醚。l-赖氨酸广泛应用于动物饲料、医药和食品工业，其中l-赖氨酸约90％用于饲料工业，10％用于食品和医药行业。用于动物饲料添加剂，l-赖氨酸可帮助机体吸收其他氨基酸，从而提高饲料的质量和利用效价。随着发展，人们对肉类食物的需求日益增加。作为主要的饲料添加剂，l-赖氨酸的需求量呈上升趋势增长。
4、目前，l-赖氨酸的主流生产方法为微生物发酵法，微生物发酵法具有原料成本低、反应条件温和、容易实现大规模生产等优点。赖氨酸工业生产菌株包括大肠杆菌和谷氨酸棒杆菌，谷棒菌株由于其生物安全性，制备低含量饲料产品时无需考
5、天然的谷氨酸棒杆菌即可用于生产氨基酸，比如谷氨酸和赖氨酸，进一步通过诱变或基因工程改造后，菌种的生产性能可大大提高。对于高性能的生产菌种，其后期提升的空间极小，且容易发生代谢不稳定的现象，给工业生产带来波动和影响生产成本。
6、因此，有必要对谷氨酸棒杆菌发酵生产氨基酸进行进一步研究。
技术实现思路
1、本专利技术的目的是提供一种可高效、稳定生产赖氨酸的重组微生物。
2、本专利技术的技术方案如下：
3、一种重组微生物的构建方法，其包括使出发菌株强化表达基因lysc、asd、dapa、dapb和ddh，并失活或弱化表达基因pck和dapd的步骤。
4、本专利技术的构建方法还包括使出发菌株强化表达基因tkt、gnd的步骤。
5、本专利技术的构建方法还包括使出发菌株强化表达基因pyc、aspa、acea和aceb，并失活或弱化表达基因hom和ldha，弱化icd基因编码的异柠檬酸脱氢酶的表达活性的步骤。
6、本专利技术的构建方法还包括使出发菌株强化表达基因lysg和lyse，并失活或弱化表达基因gntr的步骤。
7、本专利技术经过多年的菌种研发和生产分析，通过代谢工程手段，对出发菌株中，赖氨酸合成相关的基因进行表达优化。优选经过十步遗传操作，实现对赖氨酸合成相关的二十个关键基因的表达/识别性能的特定优化，从而获得赖氨酸生产性能提升的发酵菌。
8、本专利技术首先，优先强化末端合成途径，包括对以下基因lysc、asd、dapa、dapb、ddh进行表达强化，和对dapd基因进行失活改造。
9、其次，强化还原力辅因子的供应，包括对以下基因tkt、gnd进行强化表达。
10、再次，对中央代谢进行优化，目的是将代谢流平衡的牵引到天冬氨酸节点，进而强化赖氨酸的合成供应。涉及到的基因包括糖酵解、柠檬酸循环和乙醛酸循环，优选对以下基因pyc、aspa、acea、aceb进行强化，对以下基因ldha进行弱化或失活改造，并弱化icd基因编码的异柠檬酸脱氢酶的表达活性。
11、最后，强化赖氨酸外排蛋白的表达，强化的方式可为增加基因的拷贝数，同时增加外排蛋白的编码基因和其感应蛋白的编码基因的拷贝数。拷贝数的增加可以是原位串联，也可以是异位插入，或者同时对其他目标缺失基因进行失活插入改造。
12、本专利技术优选同时失活转录调控因子gntr。对于特定转录调控因子进行干扰，可以影响菌株的全局调控，进而影响菌株性能。
13、本专利技术的构建方法中，强化表达基因的方式可选自如下(1)-(3)中的一种或多种：
14、(1)对基因的内源启动子进行突变或替换为更强的启动子；
15、(2)增加基因的拷贝数；
16、(3)对基因的编码区进行突变(使其在氨基酸水平发生变化)；
17、和/或，失活或弱化表达基因的方式可选自如下(1)-(3)中的一种或多种：
18、(1)对基因的内源启动子进行突变或替换为更弱的启动子；
19、(2)减少基因的拷贝数；
20、(3)对基因的编码区进行突变(使其在氨基酸水平发生变化)。
21、基因的弱化或失活改造优选对基因的编码区进行缺失突变，或同时进行其他基因的插入改造，一步实现目标缺失基因的失活改造和目标过表达基因的异位插入改造。
22、优选，本专利技术的构建方法中，通过突变lysc基因的启动子，并改变lysc基因的起始密码子来强化lysc基因的表达；和/或，
23、通过突变lysc基因的启动子，来强化asd基因的表达(asd基因的表达受lysc基因的启动子调控，故通过突变lysc基因的启动子可同时实现lysc基因和asd基因的表达强化)；
24、和/或，通过缺失dapd基因，并在dapd基因缺失处增加一个ddh基因拷贝来同时失活dapd基因并强化ddh基因的表达；
25、和/或，通过缺失pck基因，并在pck基因缺失处增加一个dapb-dapa基因拷贝来同时失活pck基因并强化dapb-dapa基因的表达；
26、和/或，通过在gnd基因的起始密码子前引入人工强启动子来强化gnd基因的表达；
27、和/或，通过突变tkt基因的启动子来强化tkt基因的表达；
28、和/或，通过缺失hom基因，并在hom基因缺失处增加一个突变的pyc基因拷贝来同时失活hom基因并强化pyc基因的表达；
29、和/或，通过缺失ldha基因，并在ldha基因缺失处增加一个aspa基因拷贝来同时失活ldha基因并强化aspa基因的表达；
30、和/或，通过突变acea、aceb基因的启动子，并更改ramb基因对acea、aceb基因的识别序列来强化acea和aceb基因的表达；
31、和/或，通过在icd基因的编码区引入突变来弱化icd基因编码的异柠檬酸脱氢酶的表达活性；
32、和/或，通过缺失gntr基因，并在gntr基本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种重组微生物的构建方法，其特征在于，包括使出发菌株强化表达基因lysC、asd、dapA、dapB和ddh，并失活或弱化表达基因pck和dapD的步骤。
2.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，还包括使出发菌株强化表达基因tkt、gnd的步骤。
3.根据权利要求2所述的构建方法，其特征在于，还包括使出发菌株强化表达基因pyc、aspA、aceA和aceB，并失活或弱化表达基因hom和ldhA，弱化icd基因编码的异柠檬酸脱氢酶的表达活性的步骤。
4.根据权利要求3所述的构建方法，其特征在于，还包括使出发菌株强化表达基因lysG和lysE，并失活或弱化表达基因gntR的步骤。
5.根据权利要求1-4任一项所述的构建方法，其特征在于，强化表达基因的方式可选自如下(1)-(3)中的一种或多种：
6.根据权利要求1-4任一项所述的构建方法，其特征在于，通过突变lysC基因的启动子，并改变lysC基因的起始密码子来强化lysC基因的表达；和/或，
7.根据权利要求6所述的构建方法，其特征在于，
9.权利要求8所述的重组微生物的如下任一种应用：
10.一种发酵生产赖氨酸的方法，其特征在于，包括培养权利要求8所述的重组微生物的步骤。
...【技术特征摘要】
1.一种重组微生物的构建方法，其特征在于，包括使出发菌株强化表达基因lysc、asd、dapa、dapb和ddh，并失活或弱化表达基因pck和dapd的步骤。
2.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，还包括使出发菌株强化表达基因tkt、gnd的步骤。
3.根据权利要求2所述的构建方法，其特征在于，还包括使出发菌株强化表达基因pyc、aspa、acea和aceb，并失活或弱化表达基因hom和ldha，弱化icd基因编码的异柠檬酸脱氢酶的表达活性的步骤。
4.根据权利要求3所述的构建方法，其特征在于，还包括使出发菌株强化表达基因lysg和lyse，并失活或弱化表达基因gnt...
【专利技术属性】
技术研发人员：胡丹，王亚迪，冯帆，赵津津，李岩，
申请(专利权)人：廊坊梅花生物技术开发有限公司，
类型：发明
国别省市：
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