【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生物工程，具体涉及一种针对紫色色杆菌来源转氨酶改造的转氨酶突变体、编码基因及其在制备(r)-3-氨基丁醇中的应用。
技术介绍
1、度鲁特韦(dolutegravir，dtg)，化学名：(4r,12as)-n-[(2,4-二氟苯基)甲基]-3,4,6,8,12,12chemicalbooka-六氢-7-羟基-4-甲基-6,8-二氧代-2h-吡啶并[1',2':4,5]吡嗪并[2,1-b][1,3]噁嗪-9-甲酰胺，cas登录号:1051375-16-6。度鲁特韦是一种针对人类免疫缺陷病毒类型1(hiv-1)整合酶的抑制剂，主要用于治疗艾滋病病毒感染，对于遏制艾滋病传播具有至关重要的作用。
2、(r)-3-氨基丁醇是合成度鲁特韦的重要手性六元环构建块，在度鲁特韦的合成过程中，(r)-3-氨基丁醇的手性纯度决定了后续中间体的纯度，对合成高质量的度鲁特韦起到重要作用。光学纯度对于药物及其中间体的应用具有显著的影响。不同立体异构体在生物学上可能表现出各不相同的活性、代谢动力学和毒性。高光学纯度是确保药物能够以最佳方式与靶标分子相互作用，提高药物效力的关键因素。
3、因此，开发一种高效合成(r)-3-氨基丁醇的方法尤其是高光学纯度的合成方法有助于提升药物制备的效率、降低生产成本。
4、目前高光学纯度的(r)-3-氨基丁醇的合成方法主要包括化学法和生物法。化学法中常见的方法是使用四氢铝锂等作为还原剂的动力学拆分法，以及以手性化合物作为起始原料的直接合成方法。然而，这些方法存在着原材料原子利用率
5、相较于化学合成法，生物合成法具有反应条件温和、转化率高以及立体选择性强等优点。例如专利文献cn104131048a公开通过基因工程技术将来源于arthrobacter.sp的d-转氨酶基因克隆到大肠杆菌宿主细胞中，表达获得重组d-转氨酶，最后以3-羰基丁醇为底物，催化反应获得(r)-3-氨基丁醇。转氨酶能够不对称催化潜在手性酮类化合物直接合成手性胺类化合物，在应用方面具有较好的前景。
6、然而，在实际应用中，野生型转氨酶在催化非天然底物的立体选择性往往不能满足实际应用的需求，需要借助蛋白质工程技术进行改造。例如专利文献cn108823179a公开对源自放线菌的转氨酶进行改造，将第80位缬氨酸突变为甘氨酸，第203位色氨酸突变为丝氨酸，第294位苏氨酸突变为丝氨酸，获得突变体蛋白，其对底物转化率提高了12％-25％。
7、目前满足工业应用需求的转氨酶仍较为有限，因此深入挖掘不同来源的转氨酶，借助蛋白质工程技术进行分子改造，以期拓宽转氨酶在手性药物制造行业中的应用空间。
技术实现思路
1、本专利技术的目的在于提供一种催化活力高、立体选择性强的转氨酶用于制备高光学纯度(r)-3-氨基丁醇，满足工业化生产的要求。
2、为实现上述目的，本专利技术采用如下技术方案：
3、本专利技术通过蛋白质工程技术对紫色色杆菌(chromobacterium violaceum)来源的转氨酶cvata进行氨基酸突变获得转氨酶突变体，即所述转氨酶突变体是氨基酸序列如seqid no.1所示的紫色色杆菌来源转氨酶通过氨基酸突变所得的突变体，具体的，所述氨基酸突变的位点为第118位、第225位、第418位中的至少一个，且第118位的天冬酰胺突变为甘氨酸，第225位的甘氨酸突变为丙氨酸，第418的半胱氨酸突变为苏氨酸。
4、具体的，突变体n118g为第118位的天冬酰胺突变为甘氨酸，氨基酸序列如seq idno.3所示。
5、突变体g225a为第225位的甘氨酸突变为丙氨酸，氨基酸序列如seq id no.4所示。
6、突变体c418t为第418的半胱氨酸突变为苏氨酸，氨基酸序列如seq id no.5所示。
7、突变体n118g/g225a为第118位的天冬酰胺突变为甘氨酸且第225位的甘氨酸突变为丙氨酸，氨基酸序列如seq id no.6所示。
8、突变体n118g/c418t为第118位的天冬酰胺突变为甘氨酸且第418的半胱氨酸突变为苏氨酸，氨基酸序列如seq id no.7所示。
9、突变体n118g/g225a/c418t为第118位的天冬酰胺突变为甘氨酸且第225位的甘氨酸突变为丙氨酸且第418的半胱氨酸突变为苏氨酸，氨基酸序列如seq id no.8所示。
10、研究表明，相较于野生型转氨酶，上述转氨酶突变体的催化活力和立体选择性显著提升。
11、对所述转氨酶突变体的其他氨基酸位点的保守取代形式、增加或缺失一个或几个氨基酸的形式、氨基端截断的形式、羧基端截断的形式，这些突变体形式也包括在本专利技术的范围内。
12、本专利技术通过对紫色色杆菌来源的转氨酶编码基因进行定点突变，再克隆到宿主细胞中构建基因工程菌，通过诱导表达获得所述转氨酶突变体。
13、本专利技术还提供了用于编码所述转氨酶突变体的编码基因。本专利技术可以根据基因工程菌宿主细胞密码子偏好性对编码基因进行优化。进一步的，所述突变体编码基因在seqid no.2所示核苷酸序列的基础上对编码相应氨基酸的密码子进行突变获得。具体的，n118g为编码第118位天冬酰胺的密码子aat突变为编码甘氨酸的密码子ggc，g225a为编码第225位甘氨酸的密码子ggc突变为编码丙氨酸的密码子gcg，c418t为编码第418位半胱氨酸的密码子tgt突变为编码苏氨酸的密码子acc。
14、本专利技术还提供了包含编码所述的转氨酶突变体氨基酸序列的编码基因的重组表达载体。优选的，所述重组表达载体以pet30a为载体质粒。
15、本专利技术还提供了包含所述重组表达载体的基因工程菌，所述基因工程菌用于生产所述的转氨酶突变体。所述重组载体转化宿主细胞获得重组基因工程菌，所述宿主细胞可以为本领域的各种常规宿主细胞，作为优选，基因工程菌的宿主菌采用大肠杆菌e.coli，具体的，可采用e.coli bl21。
16、本专利技术还提供了一种构建所述转氨酶突变体的方法，所述方法包括以下步骤：
17、(1)设计定点突变引物，以携带有紫色色杆菌来源转氨酶编码基因的质粒为模板，进行反向pcr，获得转氨酶中第118位n突变为g或第225位g突变为a或第418位c突变为t的单位点突变产物；
18、(2)以单位点突变产物为模板，利用所述定点突变引物进行反向pcr获得双位点突变产物；以双位点突变产物为模板，利用所述定点突变引物进行反向pcr获得三位点突变产物；
19、(3)将所述单位点突变产物、双位点突变产物或三位点突变产物转化至宿主菌，筛选获得转氨酶突变体表达菌株，诱导表达，获得所述的转氨酶突变体。
20、其中第118位n突变为g所需的引物：
21、n118g-f:5’-cgcgtgttttatac本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种高立体选择性转氨酶突变体，其特征在于，所述转氨酶突变体是氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的紫色色杆菌来源转氨酶通过氨基酸突变所得的突变体，其中，所述氨基酸突变的位点为第118位、第225位、第418位中的至少一个，且第118位的天冬酰胺突变为甘氨酸，第225位的甘氨酸突变为丙氨酸，第418的半胱氨酸突变为苏氨酸。
2.如权利要求1所述的高立体选择性转氨酶突变体，其特征在于，所述突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO.3-SEQ ID NO.8所示。
3.一种转氨酶突变体基因，其特征在于，所述基因用于编码如权利要求1或2所述的高立体选择性转氨酶突变体。
4.一种重组表达载体，其特征在于，所述重组表达载体包含编码如权利要求1或2所述高立体选择性转氨酶突变体氨基酸序列的编码基因。
5.如权利要求4所述的重组表达载体，其特征在于，所述重组表达载体以pET30a为载体质粒。
6.一种用于生产如权利要求1或2所述的高立体选择性转氨酶突变体的基因工程菌，其特征在于，所述基因工程菌包含如权利要求4或5所述的重组表达载体。<...
【技术特征摘要】
1.一种高立体选择性转氨酶突变体，其特征在于，所述转氨酶突变体是氨基酸序列如seq id no.1所示的紫色色杆菌来源转氨酶通过氨基酸突变所得的突变体，其中，所述氨基酸突变的位点为第118位、第225位、第418位中的至少一个，且第118位的天冬酰胺突变为甘氨酸，第225位的甘氨酸突变为丙氨酸，第418的半胱氨酸突变为苏氨酸。
2.如权利要求1所述的高立体选择性转氨酶突变体，其特征在于，所述突变体的氨基酸序列如seq id no.3-seq id no.8所示。
3.一种转氨酶突变体基因，其特征在于，所述基因用于编码如权利要求1或2所述的高立体选择性转氨酶突变体。
4.一种重组表达载体，其特征在于，所述重组表达载体包含编码如权利要求1或2所述高立体选择性转氨酶突变体氨基酸序列的编码基因。
5.如权利要求4所述的重组表达载体，其特征在于，所述重组表达载体以pet30a为载体质粒。
6.一种用于生产如权利要求1或2所述的高立体选择性转氨酶突变体的基因工程菌，其特征在于，所述基因工程菌包含如权利要求4或5所述的重组表达载...
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