【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
1.本专利技术一般地涉及分子生物学和医学领域。更具体地，本专利技术涉及从多能干细胞产生神经元前体细胞的方法和相关的治疗方法。2.相关技术的描述帕金森病(parkinson’s disease，pd)是使人衰弱的神经退行性疾病，其由于a9中脑多巴胺能(mda)神经元的缺失和随后的多巴胺神经元信号传导的缺失而表现为运动障碍。目前的pd治疗(包括多巴胺能药物治疗和深部脑刺激(deep brain stimulation，dbs))解决了运动症状改善。预计pd的临床和社会成本将会上升，并且目前的治疗选项表现出显著的局限性。随着人口持续老龄化，预计pd将急剧上升，据保守估计，到2040年全球将有超过1400万受害者(dorsey&bloem，2018)。虽然pd患者可显示出一系列非运动特征，但其定义症状是由于继发于多巴胺能黑质神经元缺失的纹状体多巴胺能不足而引起的进行性运动缺陷。目前的治疗是对症的，主要集中于改善运动缺陷。多巴胺激动剂的递送通常仅提供轻度至中度的减轻。用l-多巴治疗需要仔细的剂量管理，通常仅在4至6年内有效，并且经常导致运动障碍。例如，经口l-多...
【技术保护点】
1.培养物，其包含中脑多巴胺能(mDA)神经元前体细胞，所述中脑多巴胺能(mDA)神经元前体细胞通过在以下信号传导调节剂的存在下培养人多能细胞而产生：
2.权利要求1所述的培养物，其中所述人多能细胞在诱导分化的条件下培养约384至约432个小时。
3.权利要求1所述的培养物，其中所述mDA神经元前体细胞不表达NURR1。
4.权利要求1至2中任一项所述的培养物，其中所述mDA神经元前体细胞表达叉头框蛋白A2(FOXA2)、LIM同源框转录因子1(LMX1)和EN1。
5.权利要求4所述的培养物，其中所述mDA神经元前体细...
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】
1.培养物，其包含中脑多巴胺能(mda)神经元前体细胞，所述中脑多巴胺能(mda)神经元前体细胞通过在以下信号传导调节剂的存在下培养人多能细胞而产生：
2.权利要求1所述的培养物，其中所述人多能细胞在诱导分化的条件下培养约384至约432个小时。
3.权利要求1所述的培养物，其中所述mda神经元前体细胞不表达nurr1。
4.权利要求1至2中任一项所述的培养物，其中所述mda神经元前体细胞表达叉头框蛋白a2(foxa2)、lim同源框转录因子1(lmx1)和en1。
5.权利要求4所述的培养物，其中所述mda神经元前体细胞还表达otx2。
6.权利要求1至5中任一项所述的培养物，其中约60％至约100％或约85％至约95％或更多的所述mda神经元前体细胞共表达叉头框蛋白a2(foxa2)和lim同源框转录因子1(lmx1)。
7.权利要求6所述的培养物，其中约65％至75％的所述mda神经元前体共表达foxa2和lmx1二者。
8.权利要求1至7中任一项所述的培养物，其中所述中脑多巴胺能前体细胞表达foxa2、lmx1a、etv5和en1；并且其中所述中脑多巴胺能前体细胞不表达nurr1、th、calb1、barhl1或grik2。
9.权利要求1至8中任一项所述的培养物，其中所述mda神经元前体细胞包含增殖细胞或分裂细胞。
10.权利要求9所述的培养物，其中至少约40％或更多的所述mda神经元前体细胞正在增殖或正在分裂。
11.权利要求10所述的培养物，其中约50％至75％的所述mda神经元前体细胞正在增殖或正在分裂。
12.权利要求1至9中任一项所述的培养物，其中所述培养物还包含约5％或更少的血清素能神经元前体细胞。
13.权利要求12所述的培养物，其中所述血清素能神经元前体细胞表达barlh1。
14.权利要求1至12中任一项所述的培养物，其中所述培养物还包含胶质祖细胞。
15.权利要求14所述的培养物，其中所述胶质祖细胞表达glast、slc13a、cd44和/或hgfap。
16.权利要求1至8中任一项所述的培养物，其中smad信号传导的所述抑制剂是bmp抑制剂。
17.权利要求16所述的培养物，其中所述bmp抑制剂是ldn-193189、多索吗啡、dmh-1、或头蛋白。
18.权利要求17所述的培养物，其中所述bmp抑制剂是ldn-193189。
19.权利要求18所述的培养物，其中所述ldn-193189以约0.2μm至约4μm的浓度存在，更优选以约1μm至约4μm的浓度存在。
20.权利要求19所述的培养物，其中所述ldn-193189以约1μm至约3μm的浓度存在。
21.权利要求19所述的培养物，其中所述ldn-193189以约0.5μm至约4μm的浓度存在。
22.权利要求21所述的培养物，其中所述ldn-193189以约0.5μm至约2μm的浓度存在。
23.权利要求19所述的培养物，其中所述ldn-193189以约0.2μm至约4μm的浓度存在。
24.权利要求23所述的培养物，其中所述ldn-193189以约0.2μm至约2μm的浓度存在。
25.权利要求1至8中任一项所述的培养物，其中所述smad信号传导抑制剂是tgfβ抑制剂。
26.权利要求25所述的培养物，其中所述tgfβ抑制剂是sb431542。
27.权利要求26所述的培养物，其中所述sb431542以约1μm至20μm的浓度存在。
28.权利要求26所述的培养物，其中所述sb431542以约5μm至15μm的浓度存在。
29.权利要求26所述的培养物，其中所述sb431542以约10μm的浓度存在。
30.权利要求1至29中任一项所述的培养物，其中所述多能细胞在培养的第1至15天、第1至16天或第1至17天与所述smad抑制剂一起培养。
31.权利要求30所述的培养物，其中所述多能细胞在培养的第1至17天与所述smad抑制剂一起培养。
32.权利要求1至31中任一项所述的培养物，其中所述多能细胞与所述smad抑制剂基本上连续地或每天一起培养，持续15、16或17天。
33.权利要求32所述的培养物，其中所述多能细胞与所述smad抑制剂基本上连续地或每天一起培养，持续17天。
34.权利要求1至33中任一项所述的培养物，其中所述smad抑制剂以约50nm至2000nm或50nm至500nm的浓度存在。
35.权利要求34所述的培养物，其中所述smad抑制剂以约180nm至240nm的浓度存在。
36.权利要求1至35中任一项所述的培养物，其中该方法还包括使所述多能细胞与mek抑制剂接触。
37.权利要求36所述的培养物，其中所述mek抑制剂是pd0325901。
38.权利要求37所述的培养物，其中所述pd0325901以约0.25μm至2.5μm的浓度存在。
39.权利要求35至38中任一项所述的培养物，其中在开始与所述smad信号传导的抑制剂接触之后，使所述mek抑制剂与所述多能细胞接触约1至3天，或者在开始与所述smad信号传导的抑制剂接触之后第1至3天、第2至4天、第3至5天、或第1、2、3、4或第5天，使所述mek抑制剂与所述多能细胞接触。
40.权利要求39所述的培养物，其中在开始与所述smad信号传导的抑制剂接触之后约24至约48小时，使所述mek抑制剂与所述多能细胞接触。
41.权利要求36至40中任一项所述的培养物，其中在开始与所述smad信号传导的抑制剂接触之后约1至2天开始，使所述mek抑制剂与所述多能细胞每天或基本上连续地接触，持续约3至4天。
42.权利要求41所述的培养物，其中在第1天开始与所述smad信号传导的抑制剂接触之后第2至5天或第3至6天，使所述mek抑制剂与所述多能细胞接触。
43.权利要求1至40中任一项所述的培养物，其中所述wnt信号传导的激活剂是gsk3抑制剂。
44.权利要求43所述的培养物，其中所述gsk3抑制剂是chir99021。
45.权利要求44所述的培养物，其中所述chir99021以约1.5μm至2μm的浓度存在。
46.权利要求44所述的培养物，其中所述chir99021以约1.5μm至1.7μm的浓度存在。
47.权利要求45所述的培养物，其中所述chir99021以约1.6μm至1.7μm的浓度存在。
48.权利要求45所述的培养物，其中所述chir99021以约1.65μm的浓度存在。
49.权利要求44所述的培养物，其中在开始与所述smad信号传导的抑制剂接触之后第9至17天，所述chir99021以约4μm至7μm的浓度存在。
50.权利要求1至49中任一项所述的培养物，其中在开始与所述smad的信号传导抑制剂接触之后1至3天，使所述wnt信号传导的激活剂与所述多能细胞接触。
51.权利要求50所述的培养物，其中在开始与所述smad信号传导的抑制剂接触之后24至48小时内，使所述wnt信号传导的激活剂与所述多能细胞接触。
52.权利要求1至51中任一项所述的培养物，其中所述多能细胞与所述wnt信号传导的激活剂基本上连续地或每天一起培养，持续14、15、或约16天。
53.权利要求1至52中任一项所述的培养物，其中在开始与所述smad信号传导的抑制剂接触之后第2至17天，使所述wnt信号传导的激活剂与所述多能细胞接触。
54.权利要求1至52中任一项所述的培养物，其中所述shh信号传导的激活剂是嘌呤胺或c25ii shh。
55.权利要求54所述的培养物，其中该方法还包括使所述多能细胞与shh信号传导的两种激活剂接触。
56.权利要求55所述的培养物，其中所述shh信号传导的两种激活剂是嘌呤胺和c25iishh。
57.权利要求1至56中任一项所述的培养物，其中在开始与所述smad信号传导的抑制剂接触的同一天或者在开始与所述smad信号传导的抑制剂接触之后24至48小时内，使所述shh信号传导的至少一种激活剂与所述多能细胞接触。
58.权利要求57所述的培养物，其中在开始与所述smad信号传导的抑制剂接触的第1至7天或者在开始与所述smad信号传导的抑制剂接触之后第1至7天，使所述shh信号传导的至少一种激活剂与所述多能细胞接触。
59.权利要求1至58中任一项所述的培养物，其中该方法还包括使所述多能细胞与fgf-8接触。
60.权利要求59所述的培养物，其中不在开始与所述smad信号传导的抑制剂接触的同一天使所述fgf-8与所述多能细胞接触。
61.权利要求59至60中任一项所述的培养物，其中在开始与所述smad信号传导的抑制剂接触之后第9至17天或第11至17天，使所述fgf-8与所述多能细胞接触。
62.权利要求59至61中任一项所述的培养物，其中所述fgf-8以约50ng/ml至200ng/ml的浓度存在。
63.权利要求1至62中任一项所述的培养物，其中所述多能细胞包含在神经元启动子控制下的抗生素抗性转基因。
64.权利要求1至63中任一项所述的培养物，其中所述方法还包括通过使所述多能细胞与抗生素、化学治疗剂、dna交联剂、dna合成抑制剂或有丝分裂抑制剂接触来选择来源于所述细胞的神经细胞或中脑da神经元。
65.权利要求1至63中任一项所述的培养物，其中该方法还包括使所述多能细胞与抗生素或化学治疗剂接触。
66.权利要求64至65中任一项所述的培养物，其中所述化学治疗剂是丝裂霉素c。
67.权利要求66所述的培养物，其中在开始与所述smad信号传导的抑制剂接触之后第27、28、29和/或30天，使所述丝裂霉素c与所述多能细胞接触。
68.权利要求64至65中任一项所述的培养物，其中所述抗生素是g418(遗传霉素)。
69.权利要求1至68中任一项所述的培养物，其中该方法还包括在开始与所述smad信号传导的抑制剂接触之前，在包含rock抑制剂的培养基中培养或孵育所述多能细胞。
70.权利要求1至69中任一项所述的培养物，其中该方法还包括使所述多能细胞与blebbistatin接触。
71.权利要求1至70中任一项所述的培养物，其中所述blebbistatin在分化的第5天和第17天与所述细胞接触。
72.权利要求1至71中任一项所述的培养物，其中所述mda多巴胺能前体细胞不表达nurr1、map2或th。
73.权利要求1至72中任一项所述的培养物，其中所述mda多巴胺能前体细胞表达en1。
74.权利要求1至72中任一项所述的培养物，其中所述mda多巴胺能前体细胞表达gbx2、otx1、otx2、etv5、corin、和/或dcx。
75.权利要求1至73中任一项所述的培养物，其中所述多能细胞是人诱导多能干(ips)细胞。
76.权利要求1至75中任一项所述的培养物，其中所述lmx1是lim同源框转录因子1α(lmx1a)。
77.权利要求1至76中任一项所述的培养物，其中该方法还包括在dna酶或内切核酸酶的存在下孵育所述人多能细胞。
78.权利要求77所述的培养物，其中所述内切核酸酶是dna酶i或
79.权利要求78所述的培养物，其中所述dna酶i或以约10u/ml至20u/ml的浓度存在。
80.权利要求79所述的培养物，其中所述dna酶i或以约10u/ml至15u/ml的浓度存在。
81.权利要求77至79中任一项所述的培养物，其中在开始与所述smad信号传导的抑制剂接触之后第4至6天中的至少一者，在内切核酸酶的存在下培养所述人多能细胞。
82.权利要求77至79中任一项所述的培养物，其中在开始与所述smad信号传导的抑制剂接触之后第5天，在内切核酸酶的存在下培养所述人多能细胞。
83.权利要求1至82中任一项所述的培养物，其中所述培养物包含在容器装置中。
84.权利要求1至83中任一项所述的培养物，其中所述中脑多巴胺能神经元前体细胞包含在药物制剂中。
85.权利要求5所述的培养物，其中所述药物制剂被配制成用于注射。
86.权利要求1至85中任一项所述的培养物，其中所述培养物包含约2,500个细胞/μl至约150,000个细胞/μl、约2,500个细胞/μl至约100,000个细胞/μl、约10,000个细胞/μl至约150,000个细胞/μl、约40,000个细胞/μl至约100,000个细胞/μl、或约15,000至45,000个细胞/μl的中脑多巴胺能神经元前体细胞。
87.权利要求1至86中任一项所述的培养物，其中所述培养物中约10％或更少、更优选约7％或更少的细胞是血清素能前体细胞。
88.权利要求87所述的培养物，其中所述培养物中约5％或更少的细胞是血清素能前体细胞。
89.权利要求87所述的培养物，其中所述培养物中约5％或更少的细胞表达sert和tph2。
90.权利要求1至89中任一项所述的培养物，其中所述培养物中约0.1％至5％或更少的细胞表达foxg1，和/或其中所述培养物中约0.1％至5％或更少的细胞表达pax6。
91.权利要求90所述的培养物，其中所述培养物中少于约1％的细胞表达foxg1，和/或其中所述培养物中少于约1％的细胞表达pax6。
92.在哺乳动物对象中治疗疾病的方法，其包括向所述对象施用治疗有效量的权利要求1至91中任一项所述的培养物，优选地其中向所述对象的脑施用所述培养物。
93.权利要求92所述的方法，其中所述哺乳动物对象是人。
94.权利要求93所述的方法，其中所述疾病是中枢神经系统(cns)的疾病。
95.权利要求94所述的方法，其中所述疾病是帕金森病(pd)或帕金森叠加综合征(pps)。
96.权利要求92至95中任一项所述的方法，其中所述培养物包含表达锯齿状蛋白但不表达nurr1的mda前体细胞。
97.权利要求96中任一项所述的方法，其中向所述对象的纹状体，例如壳核或黑质施用所述培养物。
98.权利要求97所述的方法，其中向所述对象的纹状体或壳核中的多于一个位置施用所述培养物。
99.权利要求97所述的方法，其中向所述对象的纹状体或壳核中多个部位处和/或多个针道处施用所述培养物。
100.权利要求96所述的方法，其中所述培养物包含在药物组合物中。
101.权利要求100所述的方法，其包括透明质酸基质。
102.权利要求92至101中任一项所述的方法，其中所述培养物包含约1e6至约25e6，更优选约3e6至约9e6个细胞。
103.权利要求92至102中任一项所述的方法，其中所述培养物包含约2,500个细胞/μl至约150,000个细胞/μl。
104.权利要求103所述的方法，其中所述培养物包含约10,000个细胞/μl至约150,000个细胞/μl。
105.权利要求103所述的方法，其中所述培养物包含约40,000个细胞/μl至约100,000个细胞/μl。
106.权利要求92至105中任一项所述的方法，其中所述对象患有帕金森病，并且其中所述对象在施用所述培养物之后表现出至少一种运动症状的改善。
107.权利要求106所述的方法，其中所述对象表现出以下中一者或更多者的减轻：震颤、肌僵硬、运动缓慢、跌倒、头晕、运动冻结、肌痉挛或肌张力障碍。
108.权利要求92至107中任一项所述的方法，其中所述中脑多巴胺能前体细胞至少部分地重新神经支配所述对象的纹状体或壳核。
109.权利要求92至108中任一项所述的方法，其中所述中脑多巴胺能前体细胞在所述...
【专利技术属性】
技术研发人员：克里斯托弗·麦克马洪，兰德尔·利尔里什，卡里埃·查韦斯，凯拉·汤姆普森，
申请(专利权)人：富士费勒姆细胞动力学有限公司，
类型：发明
国别省市：
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