【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及一种制备用作用于再生医学的再生生物反应器的巨噬细胞的方法。本专利技术公开的方法特别涉及通过由肿瘤细胞系或从肿瘤块解离的肿瘤细胞、或解离的肿瘤外植体或肿瘤切除物和特定氧分压调节的培养基体外活化巨噬细胞。由此获得的巨噬细胞呈现出在其他极化表型(包括m2巨噬细胞)中不存在的独特再生表型。本文定义的小鼠来源细胞的再生生物反应器表型包括广泛表达:金属蛋白酶(包括mmp8、mmp9、mmp10、mmp12、mmp14、mmp19、mmp27)、营养因子(包括vegf、fgf、igf)、以及细胞接触和粘附分子(包括rap2a、ninj1、antxr2、itga1、itga6、itga9、itgam、adamtsl4、adamtsl6)、促进存活(包括rtn4rl2)和免疫调节的介导物(包括arg1、cxcl1、cxcl2、cxcl3、cxcl16、fcgr1、fcgr4、ltb4r1、jmjd6)。本文定义的人源细胞的表型包括广泛表达与以下有关的基因：伤口愈合(包括adm、bnip3、pdgfb、vegfa)、血管生成(包括vegfa、angptl4、cxcl8、lep、rora、apln)、解毒和防御反应调节(包括ndrg1、mt1e、mt1f、mt1g、mt1h、mt1x、mt2a、mt3、ddit4、nupr1)、对缺氧的反应(包括hk2、pfkfb3、slc2a1、slc2a3、cxcr4、plin2、adm、bnip3、lep、rora、ndrg1、egln3、mt3、plod2、hilpda、angptl4)、胞外基质重塑(包括mmp9、v
技术介绍
1、中枢神经系统(cns)包括协调高级功能(认知)的大脑和主要充当大脑与外周(外感受和运动)之间的沟通通路的脊髓。与其他人体组织不同，神经组织的再生能力较差，神经组织病变不能自发愈合[1]。神经组织病变不会自发愈合。在cns中，丧失的组织被具有神经胶质、纤维化成分并由炎症免疫细胞构成的疤痕组织取代[2]。病变的演变涉及由疤痕组织替代神经组织，从而导致神经元连接的连续性及其功能的丧失以及出现失能。cns损伤导致的失能取决于损伤的方式、严重程度和解剖位置。
2、全球每年约有250-500,000人遭受脊柱损伤，导致高昂的医疗费用(估计约为1-400万欧元/患者)[3,4]。尽管社会和经济成本很高，但目前针对脊柱损伤护理开发的可能治疗方法很少。此外，目前可用的疗法只能限制脊柱创伤引起的继发性损伤，并保留病变部位完整的少数轴突连接。在过去的30年里，科学界开发了许多方法，使脊髓损伤(sci)后的存活率大大提高，但仍然没有有效的疗法来治疗脊髓损伤，从而达到最佳的完全活动康复效果。在病理层面上，脊柱损伤导致损伤部位的神经元成分丧失，从而导致cns和周围(肌肉)之间的脉冲传递中断。神经组织变性是组织缺血、细胞死亡和炎症等复杂现象的结果。
3、cns病变的病理微环境，诱导神经损伤进展并阻止神经组织再生(生物需要)
4、除了神经组织损伤造成的原发性损伤外，还有由于血液灌注减少而造成的继发性损伤，包括维持神经细胞新陈代谢的底物(o2和营养物质)供应不足，血管通透性增加，引起水肿和炎症浸润，进一步压迫病灶周围的神经组织，加重病变。这些复杂的情况增加了主要相关区域周围神经组织细胞的死亡。为了限制损伤区域，会产生强烈的炎症，星形胶质细胞的反应性激活界定了病变范围。形成胶质瘢痕的星形胶质细胞与炎症免疫细胞，特别是炎症巨噬细胞(称为m1)和基质细胞一起产生一种特征性的胞外基质，其填充病变区域但抑制轴突生长和神经细胞分化。此外，炎症成分被细胞死亡慢性激活，并导致病灶微环境损伤和神经组织损伤的慢性进展。因此，病理-生理过程表明多种因素的复杂参与导致神经组织病变的形成、进展和慢性化[4-6]。目前，针对以神经组织丧失为特征的疾病的再生医学方法主要基于使用干细胞来替代(细胞替代)丧失的神经组织。为此，已经测试了胚胎干细胞(esc)和/或胎儿神经干细胞(nsc)及其神经分化衍生物(例如少突胶质细胞前体)或神经分化诱导多能细胞(ipsc)(ipsc-nsc)[7,8]。这些疗法尚未在本专利技术人使用的以完全挫伤性脊髓损伤为特征的严重神经变性模型中显示出临床功效。
5、在寻找可以由患者本人直接获取然后移植用于再生目的(自体环境)的细胞来源的过程中，还测试了许多其他成体干细胞群。然而，这些研究显示了这些治疗的部分益处，不是通过注射到神经细胞中的细胞的直接分化来支持，而是通过“旁观者(bystander)”效应，即营养和炎症调节来支持。显示这些特性的干细胞包括成体神经干细胞(ansc，仅存在于小鼠中)、造血干细胞(hsc)和源自骨髓(bm-)或脂肪组织(a-)的间充质干细胞(msc)[7]。这些细胞类型具有不同的功效，表现出一定的再生能力，为受损组织提供营养因子并减少炎症。然而，这些方法在治疗严重的慢性神经退行性疾病方面还不够有效。作为最后一类细胞，最近还测试了包括巨噬细胞在内的免疫细胞的再生能力。静脉内注射或神经组织损伤部位诱导的m2表型巨噬细胞已显示出部分再生功效，尽管所使用的模型并不对应于严重和慢性神经退行性疾病[9]。m2巨噬细胞移植的治疗效果在一项针对脊髓损伤患者的ii期临床试验中进行了测试。尽管m2移植没有显示任何显著的不良事件，但该研究未能证明接受m2治疗的患者与未接受治疗的对照患者的主要结果存在显著差异[10]。因此lammertse等的研究不支持自体m2巨噬细胞治疗急性完全性sci的疗效。
6、总之，现有技术分析表明仍然需要能够治疗以神经组织严重丧失为特征的疾病的疗法，因为对于这些病症没有有效的疗法。
技术实现思路
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1.一种用于在从生物样品中分离的单核吞噬细胞群体中诱导表型和/或功能变化的体外或离体方法，包括在包含从肿瘤培养物或外植体释放的因子的培养基中孵育所述群体，
2.如权利要求1所述的方法，其中所述单核吞噬细胞是单核细胞和/或所述孵育的单核吞噬细胞群体是从生物样品分离的单核细胞的体外培养物和/或其中所述培养基包含能够将单核细胞分化为巨噬细胞的因子，例如巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)。
3.如权利要求1或2所述的方法，其中将所述群体孵育6小时或12小时至20天，更优选6小时至10天或优选6小时至72小时或3-8天，甚至更优选18小时至24小时或6天，甚至更优选18小时或7天。
4.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述诱导表型和/或功能变化的单核吞噬细胞是巨噬细胞。
5.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述培养基包括肿瘤上清液，所述上清液优选获自实体瘤、肿瘤外植体或肿瘤细胞系的培养物，优选获自纤维肉瘤或神经胶质瘤或优选是肿瘤调节培养基(CTM)，优选从肿瘤细胞系、肿瘤外植体或实体瘤产生，或来自解离并铺板的体外肿瘤的切除物，优选
6.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述培养基由细胞培养基、伊氏最低必需培养基或其衍生物和/或洛斯维公园纪念研究所培养基(RPMI)1640和/或培养基199和/或费氏培养基和/或Iscove改良杜氏培养基(IMDM)，以及1-99％、优选10-90％、更优选30-50％、甚至更优选30％或50％肿瘤调节培养基(CTM)或肿瘤上清液组成。
7.能通过如权利要求1-6中任一项所述的方法获得的单核吞噬细胞，优选巨噬细胞，优选地所述吞噬细胞：
8.一种分离的单核吞噬细胞，优选巨噬细胞，其：
9.如权利要求7或8所述的单核吞噬细胞，优选巨噬细胞，其中所述吞噬细胞：
10.一种单核吞噬细胞群体，其包含至少一种如权利要求7-9中任一项所述的单核吞噬细胞。
11.如权利要求7-9中任一项所述的单核吞噬细胞或如权利要求10所述的分离的单核吞噬细胞群体，优选地所述单核吞噬细胞是巨噬细胞，其特征在于：表达表1和/或表2和/或表3，和/或表6中的至少一种基因和/或分泌表2的至少一种分子，优选其特征在于表达金属蛋白酶(例如Mmp8、Mmp9、Mmp10、Mmp12、Mmp14、Mmp19、Mmp27)和/或营养因子(例如VEGF、FGF、IGF)和/或细胞接触和粘附分子(例如Rap2A、Ninj1、Antxr2、Itga1、Itga6、Itga9、ItgaM、Adamtsl4、Adamtsl6)，和/或促进存活(例如Rtn4rl2)和/或免疫调节的介导物(例如Arg1、Cxcl1、Cxcl2、Cxcl3、Cxcl16、Fcgr1、Fcgr4、Ltb4r1、Jmjd1)和/或来自具有获得性再生特性和/或其特征在于表达至少一种与以下有关的基因：伤口愈合反应(例如Adm、Bnip3、Pdgfb、Vegfa)和/或血管生成(例如Vegfa、Angptl4、Cxcl8、Lep、Rora、Apln)和/或解毒作用和防御反应调节(例如Ndrg1、Mt1e、Mt1f、Mt1g、Mt1h、Mt1x、Mt2a、Mt3、Ddit4、Nupr1)和/或对缺氧的反应(例如Hk2、Pfkfb3、Slc2a1、Slc2a3、Cxcr4、Plin2、Adm、Bnip3、Lep、Rora、Ndrg1、Egln3、Mt3、Plod2、Hilpda、Angptl4)和/或胞外基质重塑(例如Mmp9、Vcan、Fgf11、Cxcl8、Lep、Pdgfb、Plod2、Vegfa、Angptl4、Sulf2、Egln3)和/或和神经元存活和髓鞘形成(例如Mt3、Jam2、Vldlr、Nupr1、Egln3)。
12.如权利要求7-9或11中任一项所述的单核吞噬细胞或如权利要求10或11所述的分离的单核吞噬细胞群体，优选地所述单核吞噬细胞是巨噬细胞，用于医疗用途。
13.如权利要求7-9或11中任一项所述的单核吞噬细胞或根据权利要求10或11所述的分离的单核吞噬细胞群体，优选地所述单核吞噬细胞是巨噬细胞，用于细胞治疗和/或再生医学，优选地用于组织或细胞修复、组织或细胞再生、组织重塑、伤口的治疗和/或修复和/或愈合、伤口组织损失、手术溃疡、糖尿病伤口，用于治疗变性病症，包括神经变性)、视网膜变性、遗传性疾病(如ALS)引起的变性、自身免疫性疾病(关节炎、胶原蛋白病)或甚至发生胰岛变性的糖尿病，用于治疗和/或解决炎症、组织炎症，用于治疗损伤、受损组织等，优选...
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】
1.一种用于在从生物样品中分离的单核吞噬细胞群体中诱导表型和/或功能变化的体外或离体方法，包括在包含从肿瘤培养物或外植体释放的因子的培养基中孵育所述群体，
2.如权利要求1所述的方法，其中所述单核吞噬细胞是单核细胞和/或所述孵育的单核吞噬细胞群体是从生物样品分离的单核细胞的体外培养物和/或其中所述培养基包含能够将单核细胞分化为巨噬细胞的因子，例如巨噬细胞集落刺激因子(m-csf)。
3.如权利要求1或2所述的方法，其中将所述群体孵育6小时或12小时至20天，更优选6小时至10天或优选6小时至72小时或3-8天，甚至更优选18小时至24小时或6天，甚至更优选18小时或7天。
4.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述诱导表型和/或功能变化的单核吞噬细胞是巨噬细胞。
5.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述培养基包括肿瘤上清液，所述上清液优选获自实体瘤、肿瘤外植体或肿瘤细胞系的培养物，优选获自纤维肉瘤或神经胶质瘤或优选是肿瘤调节培养基(ctm)，优选从肿瘤细胞系、肿瘤外植体或实体瘤产生，或来自解离并铺板的体外肿瘤的切除物，优选持续约6小时至20天，更优选约12小时至72小时的一段时间。
6.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述培养基由细胞培养基、伊氏最低必需培养基或其衍生物和/或洛斯维公园纪念研究所培养基(rpmi)1640和/或培养基199和/或费氏培养基和/或iscove改良杜氏培养基(imdm)，以及1-99％、优选10-90％、更优选30-50％、甚至更优选30％或50％肿瘤调节培养基(ctm)或肿瘤上清液组成。
7.能通过如权利要求1-6中任一项所述的方法获得的单核吞噬细胞，优选巨噬细胞，优选地所述吞噬细胞：
8.一种分离的单核吞噬细胞，优选巨噬细胞，其：
9.如权利要求7或8所述的单核吞噬细胞，优选巨噬细胞，其中所述吞噬细胞：
10.一种单核吞噬细胞群体，其包含至少一种如权利要求7-9中任一项所述的单核吞噬细胞。
11.如权利要求7-9中任一项所述的单核吞噬细胞或如权利要求10所述的分离的单核吞噬细胞群体，优选地所述单核吞噬细胞是巨噬细胞，其特征在于：表达表1和/或表2和/或表3，和/或表6中的至少一种基因和/或分泌表2的至少一种分子，优选其特征在于表达金属蛋白酶(例如mmp8、mmp9、mmp10、mmp12、mmp14、mmp19、mmp27)和/或营养因子(例如vegf、fgf、igf)和/或细胞接触和粘附分子(例如rap2a、ninj1、antxr2、itga1、itga6、itga9、itgam、ad...
【专利技术属性】
技术研发人员：I·德西莫，F·比法里，S·多尔奇，G·F·富马加利，M·洛卡蒂，
申请(专利权)人：赫莫拉有限责任公司，
类型：发明
国别省市：
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