【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物医药，具体涉及一种靶向敲除dad1基因的纳米复合物及其制备方法和应用。
技术介绍
1、膀胱癌是常见的泌尿系统恶性肿瘤，可分为非肌层浸润性膀胱癌和肌层浸润性膀胱癌。临床治疗非肌层浸润性膀胱癌的标准方案是在手术后辅助膀胱灌注化疗，然而，膀胱上皮黏膜的生理屏障使得化疗药物难以到达肿瘤部位，降低了药物在膀胱内的生物利用度，严重影响其抗肿瘤效果。即使进行多次灌注化疗，膀胱癌5年复发率仅从58.8％降到44.8％。随着肿瘤的复发，部分患者对化疗药物表现出多药耐药性，并且反复的治疗也给患者带来严重的副作用和沉重的经济负担。
2、近年来，生物大分子药物特别是抗体药物在中晚期膀胱癌的临床应用研究发展迅速，但由于膀胱上皮粘膜的屏障作用，局部灌注给药收效甚微。虽然抗体药物表现出一定治疗效果，但是所带来的系统免疫毒性及脱靶效应也严重限制了其临床应用。吴等通过氟化修饰的聚乙烯亚胺和壳聚糖载体将蜂毒肽、光敏剂或光热纳米材料透膀胱上皮粘膜递送到肿瘤部位，对膀胱癌进行化疗、光热治疗及化疗联合光热治疗，取得了一定的治疗效果，但同时也给膀胱壁等正常组织带来不可逆的损伤。
3、因此，现有技术还有待于改进和发展。
技术实现思路
1、有鉴于此，本申请提供了一种靶向敲除dad1基因的纳米复合物及其制备方法和应用，旨在解决现有临床膀胱癌灌注治疗副作用大的问题。
2、本专利技术为解决上述技术问题所采用的技术方案如下：
3、本专利技术的第一方面，提供了一种靶向敲除d
4、具体的，所述氟化聚赖氨酸纳米胶束表面带正电荷，所述靶向敲除dad1基因的基因编辑质粒带负电荷，二者通过静电作用自组装，得到所述的纳米复合物。
5、另一实施例中，所述靶向敲除dad1基因的基因编辑质粒包括靶向敲除向敲除dad1基因的crispr/cas9基因编辑系统、cas12基因编辑系统、cas13基因编辑系统、巨型核酸酶基因编辑系统、锌指核酸酶zfns基因编辑系统、转录激活样效应因子核酸酶talen基因编辑系统中的一种或多种。
6、优选的，所述靶向敲除dad1基因的基因编辑质粒是crispr/cas9基因编辑质粒；所述crispr/cas9基因编辑质粒包含编码sgrna的dna序列；所述sgrna靶向dad1基因。更优选的，所述crispr/cas9基因编辑质粒可以为plenticrispr-v2载体质粒。
7、具体的，所述crispr/cas9基因编辑质粒进入细胞后，转录形成编码cas9蛋白的mrna以及靶向dad1基因的sgrna，mrna由核糖体翻译形成cas9蛋白，再与sgrna形成复合体后进入细胞核，进而对dad1基因进行切割，下调dad1蛋白的表达，最终引起细胞凋亡。
8、另一实施例中，所述纳米复合物表面带正电荷。
9、具体的，所述纳米复合物表面的正电荷与生物膜之间存在电荷相互吸引力，可以促进复合物与生物膜的结合。纳米复合物表面的正电荷以及载体上疏水疏油的含氟烷基链能够帮助其顺利跨上皮粘膜屏障到达膀胱癌细胞处并被肿瘤细胞内吞。
10、另一实施例中，所述纳米复合物的粒径大小为160-200nm(如184.9±3.4nm)。
11、本专利技术的第二方面，提供了一种如上所述的纳米复合物的制备方法，其中，包括：
12、将氟化聚赖氨酸用有机溶剂溶解后旋蒸除去溶剂，加水溶解，超声，得到所述氟化聚赖氨酸纳米胶束；
13、将靶向敲除dad1基因的基因编辑质粒和所述氟化聚赖氨酸纳米胶束混合，室温孵育，得到所述的纳米复合物。
14、另一实施例中，所述氟化聚赖氨酸的制备方法，包括：
15、将聚赖氨酸水溶液用氢氧化钠调节至ph为7.5，冻干，得到冻干后的聚赖氨酸；
16、将所述冻干后的聚赖氨酸、七氟丁酸酐和三乙胺溶于有机溶剂，室温反应，得到所述氟化聚赖氨酸。
17、具体的，所述氟化聚赖氨酸的制备方法，将聚赖氨酸的伯胺基团与七氟丁酸酐反应，引入疏水疏油的含氟烷基，能够帮助纳米复合物顺利跨上皮粘膜屏障，到达膀胱癌细胞处并被肿癌细胞内吞。
18、所述有机溶剂可以为无水甲醇或三氯甲烷。
19、本专利技术的第三方面，提供了一种如上所述的纳米复合物在制备膀胱癌治疗药物中的应用。
20、本专利技术的第四方面，提供了一种如上所述的纳米复合物在制备dad1基因敲除试剂盒中的应用。
21、有益效果：本专利技术从tcga数据库和gsea网站中筛选得出只在膀胱癌肿瘤细胞中高表达并与细胞凋亡相关的dad1基因，通过构建靶向敲除dad1基因的基因编辑质粒，合成氟化聚赖氨酸纳米胶束，形成只需膀胱灌注即可到达肿瘤部位的纳米复合物，实现了高效的体内基因编辑，且无须担心其血液循环时间和生物安全性问题。特异性选择dad1基因进行精准治疗，能够极大减小治疗所引起的副作用，为膀胱癌的治疗提供了一种全新的策略。
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1.一种靶向敲除DAD1基因的纳米复合物，其特征在于，包括：靶向敲除DAD1基因的基因编辑质粒和氟化聚赖氨酸纳米胶束；所述基因编辑质粒和所述氟化聚赖氨酸纳米胶束通过静电作用相结合；
2.根据权利要求1所述的纳米复合物，其特征在于，所述CRISPR/Cas9基因编辑质粒为pLentiCRISPR-V2载体质粒。
3.根据权利要求1所述的纳米复合物，其特征在于，所述CRISPR/Cas9基因编辑质粒包含编码sgRNA的DNA序列；所述sgRNA靶向DAD1基因。
4.根据权利要求1所述的纳米复合物，其特征在于，所述纳米复合物表面带正电荷。
5.根据权利要求1所述的纳米复合物，其特征在于，所述纳米复合物的粒径大小为160-200nm。
6.一种如权利要求1-5任一项所述的纳米复合物的制备方法，其特征在于，包括：
7.根据权利要求6所述的纳米复合物的制备方法，其特征在于，所述氟化聚赖氨酸的制备方法，包括：
8.一种如权利要求1-5任一项所述的纳米复合物在制备膀胱癌治疗药物中的应用。
9.一种如
...【技术特征摘要】
1.一种靶向敲除dad1基因的纳米复合物，其特征在于，包括：靶向敲除dad1基因的基因编辑质粒和氟化聚赖氨酸纳米胶束；所述基因编辑质粒和所述氟化聚赖氨酸纳米胶束通过静电作用相结合；
2.根据权利要求1所述的纳米复合物，其特征在于，所述crispr/cas9基因编辑质粒为plenticrispr-v2载体质粒。
3.根据权利要求1所述的纳米复合物，其特征在于，所述crispr/cas9基因编辑质粒包含编码sgrna的dna序列；所述sgrna靶向dad1基因。
4.根据权利要求1所述的纳米复合物...
【专利技术属性】
技术研发人员：晏洋，汤栋栋，张少华，李阳阳，王志平，吴松，
申请(专利权)人：深圳市罗湖医院集团，
类型：发明
国别省市：
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