【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生物，尤其是涉及一种引物组及其应用、恒温扩增方法及其应用和文库构建方法。
技术介绍
1、环介导等温扩增法(loop-mediated isothermal amplification,lamp)是2000年开发的一种新颖的恒温核酸扩增方法，其特点是针对靶基因的6个区域设计4种特异引物，利用一种链置换dna聚合酶在等温条件(65℃左右)保温30－60分钟，即可完成核酸扩增反应。与常规pcr相比，不需要模板的热变性、温度循环、电泳及紫外观察等过程。
2、交叉引物扩增技术(crossing priming amplification，cpa)是由优思达公司独立研发成功的一种核酸恒温扩增技术。根据体系中交叉引物数量的不同，可以分为单交叉扩增和双交叉扩增两种。与环介导等温扩增法相比，交叉引物等温扩增技术没有昂贵仪器的限制，避免了环介导等温扩增技术检测时产生的eb等有害物质。
3、然而上述恒温扩增方法的扩增效率仍然不够高，有必要寻找一种新的恒温扩增技术。
4、有鉴于此，特提出本专利技术。
技术实现思路
1、本专利技术的第一目的在于提供一种引物组。
2、本专利技术的第二目的在于提供上述引物组在恒温扩增中的应用。
3、本专利技术的第三目的在于提供一种恒温扩增方法，以解决上述问题中的至少一种。
4、本专利技术的第四目的在于提供一种恒温扩增方法在文库构建中的应用。
5、本专利技术的第五目的在于提供一种文库
6、第一方面，本专利技术提供了一种引物组，包括：上游内部引物、下游内部引物、上游外部引物和下游外部引物；
7、单链模板dna从3’端至5’端依次包括1a区、2a区、待扩增片段、3a区和4a区；
8、所述上游内部引物从5’端至3’端包括依次相连的片段m、2s区、片段n和2s区，所述2s区与所述2a区互补；
9、所述下游内部引物从5’端至3’端包括依次相连的片段x、3a区、片段y和3a区；
10、所述上游外部引物由1s区组成，所述1s区与所述1a区互补；
11、所述下游外部引物由4a区组成；
12、所述片段m、片段n、片段x和片段y的核酸序列随机。
13、作为进一步技术方案，所述片段m、片段n、片段x和片段y的脱氧核糖核苷酸数量各自独立的为4-10个。
14、作为进一步技术方案，所述2s区的tm值为63-67℃；
15、优选地，所述3a区的tm值为63-67℃；
16、优选地，所述上游外部引物的tm值为58-62℃；
17、优选地，所述下游外部引物的tm值为58-62℃。
18、第二方面，本专利技术提供了一种引物组在恒温扩增中的应用。
19、第三方面，本专利技术提供了一种恒温扩增方法，以所述的引物组对单链模板dna进行扩增。
20、作为进一步技术方案，包括如下步骤：
21、a.根据单链模板dna设计得到所述的引物组；
22、b.上游内部引物和上游外部引物与单链模板dna互补结合，在链置换dna聚合酶的作用下扩增得到单链产物；
23、c.下游内部引物和下游外部引物与b步骤获得的单链产物互补结合，在链置换dna聚合酶的作用下扩增得到单链产物；
24、d.上游内部引物与c步骤获得的单链产物互补结合，在链置换dna聚合酶的作用下扩增得到双链产物和单链产物；
25、e.下游内部引物与d步骤获得的单链产物互补结合，在链置换dna聚合酶的作用下扩增得到双链产物和单链产物；
26、f.以e步骤获得的单链产物为模板，循环进行d步骤和e步骤。
27、作为进一步技术方案，所述链置换dna聚合酶包括bst dna聚合酶。
28、作为进一步技术方案，所述扩增的温度为50-68℃。
29、第四方面，本专利技术提供了一种恒温扩增方法在文库构建中的应用。
30、第五方面，本专利技术提供了一种文库构建方法，包括所述的恒温扩增方法。
31、与现有技术相比，本专利技术具有如下有益效果：
32、本专利技术提供的引物组体系简洁，能够用于恒温扩增，且扩增效率高，假阳性低。
33、本专利技术提供的恒温扩增方法，以上述引物组对单链模板dna进行扩增，该方法操作简单，反应体系简单，扩增效率高，能够用于文库的构建。
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1.一种引物组，其特征在于，包括：上游内部引物、下游内部引物、上游外部引物和下游外部引物；
2.根据权利要求1所述的引物组，其特征在于，所述片段M、片段N、片段X和片段Y的脱氧核糖核苷酸数量各自独立的为4-10个。
3.根据权利要求1所述的引物组，其特征在于，所述2s区的Tm值为63-67℃；
4.权利要求1-3任一项所述引物组在恒温扩增中的应用。
5.一种恒温扩增方法，其特征在于，以权利要求1-3任一项所述的引物组对单链模板DNA进行扩增。
6.根据权利要求5所述的恒温扩增方法，其特征在于，包括如下步骤：
7.根据权利要求6所述的恒温扩增方法，其特征在于，所述链置换DNA聚合酶包括BstDNA聚合酶。
8.根据权利要求5所述的恒温扩增方法，其特征在于，所述扩增的温度为50-68℃。
9.权利要求5-8任一项所述的恒温扩增方法在文库构建中的应用。
10.一种文库构建方法，其特征在于，包括权利要求5-8任一项所述的恒温扩增方法。
【技术特征摘要】
1.一种引物组，其特征在于，包括：上游内部引物、下游内部引物、上游外部引物和下游外部引物；
2.根据权利要求1所述的引物组，其特征在于，所述片段m、片段n、片段x和片段y的脱氧核糖核苷酸数量各自独立的为4-10个。
3.根据权利要求1所述的引物组，其特征在于，所述2s区的tm值为63-67℃；
4.权利要求1-3任一项所述引物组在恒温扩增中的应用。
5.一种恒温扩增方法，其特征在于，以权利要求1-3任一项所述的引物组对单链...
【专利技术属性】
技术研发人员：沈敏杰，周鑫鑫，王虹军，陈芝娟，贺贤汉，
申请(专利权)人：杭州博日科技股份有限公司，
类型：发明
国别省市：
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