【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及细胞培养，尤其涉及一种脐带血调节性t细胞的体外诱导培养液及其培养方法。
技术介绍
1、t淋巴细胞源于骨髓的多能干细胞(胚胎期则来源于卵黄囊和肝)。在人体胚胎期和初生期，骨髓中的一部分多能干细胞或前t细胞迁移到胸腺内，在胸腺激素的诱导下分化成熟，成为具有免疫活性的t细胞。成熟的t细胞经血流分布至外周免疫器官的胸腺依赖区定居，并可经淋巴管、外周血和组织液等进行再循环，发挥细胞免疫及免疫调节等功能。t细胞的再循环有利于广泛接触进入体内的抗原物质，加强免疫应答，较长期保持免疫记忆。t细胞的细胞膜上有许多不同的标志，主要是表面抗原和表面受体。这些表面标志都是结合在细胞膜上的巨蛋白分子。
2、t细胞是相当复杂的不均一体、又不断在体内更新、在同一时间可以存在不同发育阶段或功能的亚群。按照功能和表面标志，t细胞可以分成以下几类：1、细胞毒性t细胞(cytotoxic t cell)：消灭受感染的细胞。这些细胞的功能就像一个“杀手”或细胞毒素，因为它们可以对产生特殊抗原反应的目标细胞进行杀灭。细胞毒t细胞的主要表面标志是cd8，也被称为杀手t细胞。2、辅助t细胞(helpert cell)在免疫反应中扮演中间过程的角色：它可以增生扩散来激活其它类型的产生直接免疫反应的免疫细胞。辅助t细胞的主要表面标志是cd4。t细胞调控或“辅助”其它淋巴细胞发挥功能。它们是已知的hiv的目标细胞，在艾滋病发病时会急剧减少。3、调节/抑制t细胞(regulatory/suppressort cell，简称tregs)：负责调节机体免疫反应
3、然而，脐带血中大部分tregs主要是cd45ra+，cd45ro+较少，tregs细胞主要为初始细胞，未经活化，原因可能与胎儿一直处于相对没有抗原刺激的环境下，导致了脐血中效应t细胞数量较少。这使得脐带血t细胞应用受限。因此，如何在体外扩增tregs细胞，并使其活化，提高其免疫抑制功能，成为本领域亟需解决的问题。
技术实现思路
1、本专利技术的目的在于提供一种脐带血调节性t细胞的体外诱导培养液及其培养方法。本专利技术通过联合il-2、pha、苦杏仁苷和抗cd3抗体、抗cd28抗体，诱导脐带血中初始t细胞活化，对细胞类型进行筛选，提高了cd4+cd25+t细胞的纯度，同时通过提高调节性t细胞的活性，使其在后续增殖培养过程中，保持了较高的存活能力和免疫活性。
2、为了实现上述专利技术目的，本专利技术提供以下技术方案：
3、本专利技术提供了一种脐带血调节性t细胞的体外诱导培养液，由包括如下原料制成：基础培养基、il-2、pha、抗cd3抗体、抗cd28抗体、苦杏仁苷。
4、优选的，所述基础培养基为rpmi 1640培养基、mdm培养基或dmem培养基。
5、优选的，所述体外诱导培养液中，il-2的终浓度为1000～2000u/ml、pha的终浓度为60～150μg/ml、抗cd3抗体的终浓度为60～120ng/ml、抗cd28抗体的终浓度为30～60ng/ml、苦杏仁苷的终浓度为60～150ng/ml。
6、本专利技术还提供了一种利用上述体外诱导培养液培养脐带血调节性t细胞的方法，包括如下步骤：
7、(1)收集脐带血单个核细胞；
8、(2)将所述单个核细胞接种于所述体外诱导培养液中，培养；
9、(3)将步骤(2)培养后的细胞转移至细胞培养液中，培养，得到调节性t细胞。
10、优选的，步骤(2)所述单个核细胞的接种浓度为5～8×106个/ml。
11、优选的，步骤(2)所述培养的温度为35～38℃，时间为5～10天；所述培养过程中，每2～4天，半量换液一次。
12、优选的，步骤(3)所述细胞培养液中的细胞浓度为3～5×105个/ml。
13、优选的，所述细胞培养液为rpmi 1640培养液添加10％fbs、1500～2500u/ml il-2、80～120ng/ml抗cd28抗体、3～6ng/mltgf-β。
14、优选的，步骤(3)所述培养的温度为35～38℃，时间为6～9天；所述培养过程中，每培养3～5天，换液一次。
15、本专利技术提供了一种脐带血调节性t细胞的体外诱导培养液及其培养方法。本专利技术联合应用il-2、pha和苦杏仁苷，诱导脐带血中初始t细胞活化，提高调节性t细胞的免疫活性和增殖能力，使得tregs细胞在后续培养过程中，保持活力并稳定增殖。本专利技术再通过添加抗cd3抗体、抗cd28抗体对t细胞类型进行筛选，以提高tregs细胞纯度。在后续增殖培养过程中，使用添加有il-2、tgf-β、抗cd28抗体的培养液，更进一步提高了tregs细胞数量。本专利技术的培养方法，能够使tregs细胞数量提高960倍以上，并明显提高tregs细胞的免疫活性。本专利技术培养得到的调节性t细胞数量多、纯度高、免疫活性强，可用于治疗过度自身免疫反应、器官移植排斥等疾病，能够满足临床需求，应用前景广泛。
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1.一种脐带血调节性T细胞的体外诱导培养液，其特征在于，由包括如下原料制成：基础培养基、IL-2、PHA、抗CD3抗体、抗CD28抗体、苦杏仁苷。
2.根据权利要求1所述的体外诱导培养液，其特征在于，所述基础培养基为RPMI 1640培养基、MDM培养基或DMEM培养基。
3.根据权利要求2所述的体外诱导培养液，其特征在于，所述体外诱导培养液中，IL-2的终浓度为1000～2000U/mL、PHA的终浓度为60～150μg/mL、抗CD3抗体的终浓度为60～120ng/mL、抗CD28抗体的终浓度为30～60ng/mL、苦杏仁苷的终浓度为60～150ng/mL。
4.一种利用权利要求1～3任一项所述体外诱导培养液培养脐带血调节性T细胞的方法，其特征在于，包括如下步骤：
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤(2)所述单个核细胞的接种浓度为5～8×106个/mL。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，步骤(2)所述培养的温度为35～38℃，时间为5～10天；所述培养过程中，每2～4天，半量换液一次。
<...【技术特征摘要】
1.一种脐带血调节性t细胞的体外诱导培养液，其特征在于，由包括如下原料制成：基础培养基、il-2、pha、抗cd3抗体、抗cd28抗体、苦杏仁苷。
2.根据权利要求1所述的体外诱导培养液，其特征在于，所述基础培养基为rpmi 1640培养基、mdm培养基或dmem培养基。
3.根据权利要求2所述的体外诱导培养液，其特征在于，所述体外诱导培养液中，il-2的终浓度为1000～2000u/ml、pha的终浓度为60～150μg/ml、抗cd3抗体的终浓度为60～120ng/ml、抗cd28抗体的终浓度为30～60ng/ml、苦杏仁苷的终浓度为60～150ng/ml。
4.一种利用权利要求1～3任一项所述体外诱导培养液培养脐带血调节性t细胞的方法，其特征在于，包括如下步骤：
5.根据权利...
【专利技术属性】
技术研发人员：张军，杨业国，苏晓萍，郑荣杰，王卿，叶茂，刘维康，
申请(专利权)人：广东壹加再生医学研究院有限公司，
类型：发明
国别省市：
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