【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物技术与分子生物学，涉及一种用于检测病原微生物的引物探针组合、方法和应用。
技术介绍
1、感染性疾病主要分为细菌性感染、真菌性感染及病毒性感染(dna病毒与rna病毒)。其中，病原检测是感染性疾病诊疗中的重要一步，不同类型的病原感染在临床中采用的治疗方式差异较大，如细菌性肺炎需要使用抗生素进行治疗，真菌性肺炎常用抗真菌药物，病毒性肺炎则强调辅助增强患者自身免疫力，因此早期的病原类型检测能够协助制定患者的治疗方案，提升患者存活率。
2、目前临床中常用的感染病原类型检测手段为血常规、血清学诊断及病原微生物分离培养检测与核酸检测等，其中血常规是通过统计血细胞的数量变化和形态分布来判断血液状况和检查疾病的方法，根据统计结果可以初步诊断患者是细菌感染还是病毒感染，但血常规的准确率受多种生理因素影响，并且无法区分真菌感染类的患者，临床应用范围有限。血清学诊断是指用已知抗原检测患者血清中相应抗体的方法，这种方法虽然准确性较高，但临床周转时间较长，影响患者诊疗效率。病原微生物分离培养检测是对病原体进行体外培养后再进行生物鉴定的方法，这种方法成本低，但耗时长并且具有偏倚性。核酸检测指在核酸层面上进行的感染病原微生物检测，包括单重或多重荧光定量pcr与测序等，单重或多重pcr能够精确检测到病原物种类型，但其覆盖范围均有限，需要医生预先判断患者可能的感染方向再决定pcr靶标的范围。测序目前临床中常用的为一代测序与二代高通量测序(ngs)，一代测序通常是对病原微生物pcr扩增子进行测序，且可进一步分为tngs与mngs，其中
3、综上所述，目前检测病原微生物的方法存在覆盖范围有限，需预先确定感染范围，成本较高，临床周转时间较长，不适用于病原类型的初步诊断等问题。如何提供一种检测覆盖范围广，准确度高，灵敏度高的病原微生物检测方法，已成为目前生物技术与分子生物学
亟待解决的问题之一。
技术实现思路
1、针对现有技术的不足和实际需求，本专利技术提供一种用于检测病原微生物的引物探针组合、方法和应用，开发了一种检测病原微生物(细菌、真菌、dna病毒及rna病毒)覆盖范围广，耗时短，准确性高的病原微生物一步法多重荧光定量pcr检测方法，缓解了目前临床病原检测及诊断的压力，能够协助医生在感染性患者入院前期对其进行初步的诊疗方案制定。
2、为达到此专利技术目的，本专利技术采用以下技术方案：
3、第一方面，本专利技术提供了一种用于检测病原微生物的引物及荧光探针，所述引物的核酸序列包括seq id no.1-seq id no.42所示的序列；所述荧光探针的核酸序列包括seq id no.43-seq id no.63所示的序列。
4、本专利技术通过保守与特异相结合的引物设计方式，基于一步法荧光定量pcr技术，实现对患者病原体的病原类型进行快速区分，靶标范围覆盖广，检测效率高，引物延伸时探针保持与目标片段能够稳定结合，准确性高，能够有效避免交叉污染与气溶胶污染。
5、本专利技术中设计的引物探针如表1所示。
6、表1
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11、本专利技术所采用的一步法多重荧光定量pcr是基于多重pcr与一步法荧光定量pcr而诞生的多靶标定量检测方式，它结合了一步法荧光定量pcr的高效定量能力与多重pcr的多靶标检测能力，实现了单反应管中进行多靶基因或靶片段扩增与荧光检测。然而，实现这种高通量检测的前提在于不同靶标引物与探针之间的精密设计，以防止发生非特异扩增及引物二聚体，此外，退火温度同样需要严格把控。
12、优选地，所述荧光探针的5’端含有荧光基团，3’端含有淬灭基团。
13、优选地，所述荧光基团包括fam、cy5、vic或rox中任意一种或至少两种的组合。
14、优选地，所述淬灭基团包括bhq1、bhq2或mgb中任意一种或至少两种的组合。
15、优选地，所述病原微生物包括细菌、真菌、dna病毒或rna病毒中的任意一种或至少两种的组合。
16、优选地，所述真菌包括隐球菌属真菌、念珠菌属真菌、曲霉属真菌或肺孢子菌属真菌中的任意一种或至少两种的组合。
17、优选地，所述dna病毒包括人类疱疹病毒i、人类疱疹病毒ii、人类疱疹病毒iii、人类疱疹病毒iv、人类疱疹病毒v型、乙肝病毒、人类细小病毒b19型或腺病毒所有型中的任意一种或至少两种的组合。
18、优选地，所述rna病毒包括鼻病毒、甲型流感病毒、乙型流感病毒、冠状病毒229e、冠状病毒oc43、冠状病毒hku1、冠状病毒nl63、新型冠状病毒或肠道病毒中的任意一种或至少两种的组合。
19、第二方面，本专利技术提供了第一方面所述的用于检测病原微生物的引物及荧光探针在制备用于检测病原微生物的产品中的应用。
20、第三方面，本专利技术提供了一种检测病原微生物的试剂盒，所述试剂盒包括第一方面所述的用于检测病原微生物的引物及荧光探针。
21、第四方面，本专利技术提供了第一方面所述的用于检测病原微生物的引物及荧光探针在检测病原微生物中的应用。
22、第五方面，本专利技术提供了一种检测病原微生物的方法，所述方法包括以下步骤：
23、(1)从待测样本中提取dna作为模板，利用权利要求1或2所述的用于检测病原微生物的引物及荧光探针进行一步法荧光定量pcr扩增；
24、(2)收集并检测pcr扩增中每一反应孔的各通道荧光信号，生成扩增曲线；
25、(3)根据各通道荧光信号ct值判断待测样本中是否含有病原微生物。
26、优选地，所述病原微生物包括细菌、真菌、dna病毒或rna病毒中的任意一种或至少两种的组合。
27、优选地，所述真菌包括隐球菌属真菌、念珠菌属真菌、曲霉属真菌或肺孢子菌属真菌中的任意一种或至少两种的组合。
28、优选地，所述dna病毒包括人类疱疹病毒i、人类疱疹病毒ii、人类疱疹病毒iii、人类疱疹病毒iv、人类疱疹病毒v型、乙肝病毒、人类细小病毒b19型或腺病毒所有型中的任意一种或至少两种的组合。
29、优选地，所述rna病毒包括鼻病毒、甲型流感病毒、乙型流感病毒、冠状病毒229e、冠状病毒oc43、冠状病毒hku1、冠状病毒nl63、新型冠状病毒或肠道病毒中的任意一种或至少两种的组合。
30、优选地，步骤(2)中所述每一反应孔含有至少四种荧光通道，每种荧光通道对应一类病原。
31、优选地，步骤(2)中所述每一反应孔还包括fam、rox、vic和cy5四种荧光通道。
32、优选地，步骤(3)中所述判断的标准为：
33、检测细菌的荧光通道ct值<28，判定为细菌阳性；
【技术保护点】
1.一种用于检测病原微生物的引物及荧光探针，其特征在于，所述引物的核酸序列包括SEQ ID NO.1-SEQ ID NO.42所示的序列；所述荧光探针的核酸序列包括SEQ ID NO.43-SEQ ID NO.63所示的序列。
2.根据权利要求1所述的引物及荧光探针，其特征在于，所述荧光探针的5’端含有荧光基团，3’端含有淬灭基团；
3.权利要求1或2所述的用于检测病原微生物的引物及荧光探针，其特征在于，所述病原微生物包括细菌、真菌、DNA病毒或RNA病毒中的任意一种或至少两种的组合；
4.权利要求1-3中任一项所述的用于检测病原微生物的引物及荧光探针在制备用于检测病原微生物的产品中的应用。
5.一种检测病原微生物的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求1-3中任一项所述的用于检测病原微生物的引物及荧光探针。
6.权利要求1-3中任一项所述的用于检测病原微生物的引物及荧光探针在检测病原微生物中的应用。
7.一种检测病原微生物的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
8.根据权利要求7所述的方
9.根据权利要求7或8所述的方法，其特征在于，步骤(2)中所述每一反应孔含有至少四种荧光通道，每种荧光通道对应一类病原；
10.根据权利要求7-9所述的方法，其特征在于，所待测样本包括：血液、肺泡灌洗液、鼻咽拭子、痰液或脑脊液中的任意一种。
...【技术特征摘要】
1.一种用于检测病原微生物的引物及荧光探针，其特征在于，所述引物的核酸序列包括seq id no.1-seq id no.42所示的序列；所述荧光探针的核酸序列包括seq id no.43-seq id no.63所示的序列。
2.根据权利要求1所述的引物及荧光探针，其特征在于，所述荧光探针的5’端含有荧光基团，3’端含有淬灭基团；
3.权利要求1或2所述的用于检测病原微生物的引物及荧光探针，其特征在于，所述病原微生物包括细菌、真菌、dna病毒或rna病毒中的任意一种或至少两种的组合；
4.权利要求1-3中任一项所述的用于检测病原微生物的引物及荧光探针在制备用于检测病原微生物的产品中的应用。
5.一种检测病原微生物的试剂盒，...
【专利技术属性】
技术研发人员：王胡海灵，赵雅丽，钟佩雯，王婷，林增顺，李英镇，袁剑颖，陈嘉昌，柳俊，胡朝晖，
申请(专利权)人：广州市金圻睿生物科技有限责任公司，
类型：发明
国别省市：
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