【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及核酸杂交领域，尤其涉及一种用于放大核酸杂交信号的探针组和试剂盒。
技术介绍
1、核酸杂交是利用探针(dna或rna)检测靶标dna或rna是否存在于样本中的一种有效方法，借此鉴定样本的物种属性或物种构成。dna或rna在按照碱基配对原则进行退火时，样本中的靶标dna或rna以1:1的比例将信号传递至探针；通过酶或抗体特异识别探针上标记的报告集团(如地高辛、fitc、生物素等)，探针将靶标信号以一定的放大倍数传递至下游的检测系统；终端报告系统最终获得信号，并出具数据。
2、由于检测方法自身的缺陷(如处理对象涉及多类型样本、报告集团标记、操作环节繁杂等)，样本的靶标信号在传递过程中可能减弱或掺杂。因此，对样本信号的特异性放大成为提高检测灵敏度的一种有效方式，尤其是针对信号微弱的样本。核酸杂交操作时，至少可通过以下几个环节进行信号放大：
3、1.探针标记物数量，即一份探针对应标记物的比例。如：一个短链dna探针通过化学合成或酶促反应标记上>10个的地高辛集团；杂交时，样本的靶标信号以1:1的比例传递至探针后，探针上标记的地高辛集团(如地高辛、fitc、生物素等)就成为新的信号源，即靶标信号被放大了10倍以上。
4、2.酶或抗体的标记物，即酶或抗体以一种比例(如1:30)与另一集团(如hrp)偶联。酶或抗体以1:1的比例特异识别报告集团(如地高辛)时，酶或抗体上偶联的集团就以30倍的比例将靶标信号再次放大。
5、3.标记物的效应物，即酶或抗体上的标记物能引起化学反应或发
6、4.信号收集及数据处理，即通过信号收集系统及终端数据的计算机处理系统将靶标信号放大。
7、但是以上大多技术对放大信号放大的处理本质上是在信号传递的下游，最初的信号传递仍然是1:1，即靶标序列与探针的特异识别是1:1。这时，探针上携带的标记集团数量是固定的，即使经过下游几级放大后信号放大倍数仍然是有限的。当样本的阳性率极低时，会造成探针等物料使用冗余问题，并导致假阴性。rnascope技术通过几次放大之后能高效放大探针携带的标记集团数量，但理论上还是有限数量，且采用的rna探针制备成本高，需多次杂交操作才能完成探针聚集。
技术实现思路
1、本专利技术的目的在于提高核酸杂交的灵敏性，能将核酸杂交的微弱信号特异性地放大至可观测水平(理论上可将信号放大至探针添加量水平)，同时避免过多的使用探针及标记物。对于信号微弱的样本，检测系统若不能充分地放大信号，则不能产生有效的判定数据，并且由于过多使用探针及报告集团而造成浪费。本专利技术适用于原位杂交、斑点杂交、磁珠操作的核酸杂交等模式，通过调整探针浓度及配比，系统能在放大信号的同时控制探针的使用成本。
2、为实现上述目的，本专利技术提供一种用于放大核酸杂交信号的探针组，其特征在于，所述探针组含有三个探针，其中探针一的序列含有接头序列1，基因特异性序列；探针二的序列含有接头互补序列，尾部序列和标记序列；探针三的序列含有接头序列2，尾部互补序列和标记序列；其中接头序列与接头互补序列是反向互补关系，尾部序列与尾部互补序列是反向互补关系；接头序列1和接头序列2的碱基序列相同。
3、进一步，所述探针一的接头序列1和基因特异性序列之间有间隔序列，优选的，间隔序列为4-6个t。
4、进一步，所述基因特异性序列为靶标基因序列的互补序列，长度为50-500个碱基；接头序列1，接头序列2、接头互补序列、尾部序列及尾部互补序列的长度在28-35个碱基范围内，碱基gc含量为50％-60％；标记序列23-25个碱基，碱基t的含量80％-90％。
5、进一步，所述探针的制备方法为，先通过pcr扩增的正向引物和反向引物的退火进行pcr合成每个探针的双链dna序列，再以该双链dna为模板，以双链dna的正向引物为引物进行单引物pcr扩增，并以报告集团标记的dttp与dttp按1:5体积比的比例掺入报告基团；使用双链dna特异性核酸酶降解双链部分并纯化获得探针。
6、进一步，所述报告基因的标记是指地高辛、fitc、生物素中的一种。
7、本专利技术还提供用于放大核酸杂交信号的试剂盒，其特征在于，含有所述探针组。
8、进一步，使用方法为，
9、样本洗涤重悬后滴于玻片上，65℃烤片1小时；依次使用松节油、无水乙醇、95％乙醇、75％乙醇、蒸馏水进行脱蜡处理；甩干切片，滴加适量胃酶工作液后室温孵育，
10、滴加探针一和杂交液的混合液于上述玻片，杂交仪中过夜；洗涤并甩干；再滴加探针二和杂交液的混合液于玻片上，湿盒中反应30分钟；再滴加探针三和杂交液的混合液于玻片上，杂交仪杂交；
11、再按照免疫显色步骤进行检测即可。
12、本专利技术还提供一种用于放大核酸杂交信号的方法，其特征在于，使用了所述探针组或所述试剂盒。
13、进一步，杂交反应进行至添加探针阶段时，应按探针一、探针二、探针三的顺序依次加入到样本上，其中每两个探针加入的间隔时间不少于10分钟。
14、本专利技术针对探针的序列进行特殊设计，即多个探针通过碱基配对原则形成头尾相连的重复性聚集物。靶标信号理论上能以无限倍数形式传递至探针，再通过探针上标记的地高辛集团传递给下个环节。
15、本专利技术涉及探针的特殊设计即探针含六种序列：基因特异性序列、接头序列、接头序列互补序列、尾部序列、尾部序列互补序列和标记序列。六种序列构成探针组三个探针，其特征如下：第一个探针(即探针一)由接头序列+基因特异性序列(gsp)，接头序列和gsp之间还可以有间隔序列，(5’-->3’，下同)组成；第二个探针(即探针二)由接头序列互补序列+尾部序列+标记序列组成；第三个探针(即探针三)由接头序列+尾部序列互补序列+标记序列组成。在杂交反应时，第一个探针通过基因特异性序列与样本中的靶标序列结合，空出接头序列；第二个探针通过接头序列互补序列与第一个探针的接头序列结合，空出尾部序列；第三个探针通过尾部序列互补序列与第二个探针的尾部序列结合，空出接头序列，可与第二个探针的接头序列互补序列结合。该探针组第一个探针负责与靶标序列特异性结合，并引发探针的聚合反应；第二个探针与第三个探针负责形成头尾相连的探针聚合物；每个探针中的标记序列用于标记报告集团；三个探针在有序结合下形成每隔一定距离均标记有报告集团的直链重复式探针聚合物。在合适的反应体系中，探针间配对结合如图1所示。
16、本专利技术涉及探针的一种存在形式即单链dna，由化学合成时在间隔一定距离的t处标记地高辛或其他集团(图2下划线)；由pcr产生时，通过以下操作进行：
17、1.合成正向引物(以探针二为例)：
18、ctacagtgtcttccagtcacgagagctggactcctcacacaggacgatcgactcac；seq id no:1；本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一组用于放大核酸杂交信号的探针组，其特征在于，所述探针组含有三个探针，其中探针一的序列含有接头序列1，基因特异性序列；探针二的序列含有接头互补序列，尾部序列和标记序列；探针三的序列含有接头序列2，尾部互补序列和标记序列；其中接头序列与接头互补序列是反向互补关系，尾部序列与尾部互补序列是反向互补关系；接头序列1和接头序列2的碱基序列相同。
2.如权利要求1所述的探针组，其特征在于，所述探针一的接头序列1和基因特异性序列之间有间隔序列，优选的，间隔序列为4-6个T。
3.如权利要求1所述的探针组，其特征在于，所述基因特异性序列为靶标基因序列的互补序列，长度为50-500个碱基；接头序列1，接头序列2、接头互补序列、尾部序列及尾部互补序列的长度在28-35个碱基范围内，碱基GC含量为50％-60％；标记序列23-25个碱基，碱基T的含量80％-90％。
4.如权利要求1所述的探针组，其特征在于，所述探针的制备方法为，先通过PCR扩增的正向引物和反向引物的退火进行PCR合成每个探针的双链DNA序列，再以该双链DNA为模板，以双链DNA的正向引物为引
5.如权利要求1所述的探针组，其特征在于，所述报告基因的标记是指地高辛、FITC、生物素中的一种。
6.一种用于放大核酸杂交信号的试剂盒，其特征在于，含有权利要求1-4任一所述探针组。
7.如权利要求6所述试剂盒，其特征在于，使用方法为，
8.一种用于放大核酸杂交信号的方法，其特征在于，使用了权利要求1-4任一所述探针组或权利要求5-6任一所述试剂盒。
9.如权利要求8所述方法，其特征在于，杂交反应进行至添加探针阶段时，应按探针一、探针二、探针三的顺序依次加入到样本上，其中每两个探针加入的间隔时间不少于10分钟。
...【技术特征摘要】
1.一组用于放大核酸杂交信号的探针组，其特征在于，所述探针组含有三个探针，其中探针一的序列含有接头序列1，基因特异性序列；探针二的序列含有接头互补序列，尾部序列和标记序列；探针三的序列含有接头序列2，尾部互补序列和标记序列；其中接头序列与接头互补序列是反向互补关系，尾部序列与尾部互补序列是反向互补关系；接头序列1和接头序列2的碱基序列相同。
2.如权利要求1所述的探针组，其特征在于，所述探针一的接头序列1和基因特异性序列之间有间隔序列，优选的，间隔序列为4-6个t。
3.如权利要求1所述的探针组，其特征在于，所述基因特异性序列为靶标基因序列的互补序列，长度为50-500个碱基；接头序列1，接头序列2、接头互补序列、尾部序列及尾部互补序列的长度在28-35个碱基范围内，碱基gc含量为50％-60％；标记序列23-25个碱基，碱基t的含量80％-90％。
4.如权利要求1所述的探针组，其特征在于，所述探针的制备方法为，...
【专利技术属性】
技术研发人员：程文金，吴荣火，刘鹭，丁鹏飞，丘加肯，揭育阳，
申请(专利权)人：厦门龙进生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：
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