【技术实现步骤摘要】
本申请涉及基于酵母的合成倍半萜瓦伦烯的方法，属于微生物代谢工程及工业生物。
技术介绍
1、自然界中存在至少80000多种萜类化合物，具有多种生理功效，在人们的日常生活中发挥重要的作用。近年来随着合成生物学的快速发展，加速了构建微生物细胞工厂的进程。酿酒酵母是公认安全(generally recognized as safe,gras)的微生物，千年来一直用于生产啤酒、面包、葡萄酒以及一些发酵产品。1996年完成酿酒酵母基因组测序后，酿酒酵母的基因操作手段日益成熟。然而，目前在酵母细胞工厂中合成萜类化合物一直都是使用甲羟戊酸途径，有研究尝试将在酿酒酵母中构建异源mep途径，然而酵母胞质内缺乏激活mep途径所需要的电子转移系统。目前新途径的探索都仅在大肠杆菌中进行，真核生物如酵母中的应用研究暂时未见报道。急需拓展更多的萜类合成途径来更有效的在酵母中合成萜类化合物，为真核生物合成萜类化合物带来更多的选择。
技术实现思路
1、本申请提供了基于酵母的合成倍半萜瓦伦烯的方法，所述合成倍半萜瓦伦烯途径包括嗜盐古菌haloferaxvolcanii型修饰的甲羟戊酸途径和嗜酸热原体古菌thermoplasmaacidophilum型修饰的甲羟戊酸途径，嗜盐古菌haloferaxvolcanii型修饰的甲羟戊酸途径合成萜类化合物比目前常用的经典甲羟戊酸途径效果更好，可有效提高萜类化合物产量。本申请采用如下的技术方案实现：
2、基于酵母的合成倍半萜瓦伦烯的方法，所述倍半萜瓦伦烯合成途径包括嗜
3、可选地，所述基因分别为乙酰乙酰辅酶a硫酶erg10、3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶a合酶erg13、3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶a还原酶hmgr、甲羟戊酸激酶erg12、磷酸甲羟戊酸脱羧酶pmd、异戊烯基磷酸激酶ipk和异戊烯基二磷酸异构酶idi1。
4、可选地，所述erg10、erg13、hmgr和erg12来源于saccharomyces cerevisiae；
5、可选地，所述pmd来源于haloferaxvolcanii经密码子优化；
6、可选地，所述ipk来源于arabidopsis thaliana经密码子优化。
7、可选地，所述基因分别为乙酰乙酰辅酶a硫酶erg10、3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶a合酶erg13、3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶a还原酶hmgr、甲羟戊酸-3-磷酸激酶m3k、甲羟戊酸-3-磷酸5-激酶m3k5p、磷酸甲羟戊酸脱羧酶bmd和异戊烯基二磷酸异构酶idi1。
8、可选地，所述erg10、erg13和hmgr来源于saccharomyces cerevisiae。
9、可选地，所述m3k、m3k5p和bmd来源于thermoplasmaacidophilum经密码子优化。可选地，所述嗜盐古菌haloferaxvolcanii型修饰的甲羟戊酸途径基因全部表达后，再增加erg12和ipk拷贝数提高瓦伦烯生物合成效率。
10、可选地，所述嗜盐古菌haloferaxvolcanii型修饰的甲羟戊酸途径基因全部表达后，强化乙酰辅酶a到3-羟基-3-甲基戊二酸单酰辅酶a合成途径中的酶。
11、可选地，采用如下基因强化乙酰辅酶a到3-羟基-3-甲基戊二酸单酰辅酶a合成途径中的酶：来源于粪肠球菌enterococcus faecalis且经密码子优化的3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶a合酶基因efmvas和双功能酶乙酰乙酰辅酶a硫解酶和3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶a还原酶efmvae。
12、可选地，所述3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶a合酶基因efmvas、双功能酶乙酰乙酰辅酶a硫解酶和3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶a还原酶efmvae通过在染色体上整合dna片段得到；
13、所述dna片段为：tprm9-efmvae-pgal10-1-efmvas-tidp1。
14、可选地，所述dna片段的整合位点为viii-1。
15、可选地，所述嗜盐古菌haloferaxvolcanii型修饰的甲羟戊酸途径基因全部表达后，增加瓦伦烯合酶拷贝数和过氧化物酶体数量。
16、可选地，所述嗜盐古菌haloferaxvolcanii型修饰的甲羟戊酸途径增加瓦伦烯合酶拷贝数和过氧化物酶体数量通过分别在染色体上整合dna片段得到；
17、所述dna片段依次为：tprm9-pgal10-1-cnvs-tdit1、pgal2-cnvs-tdit1和tprm9-pgal10-1-pex28-tdit1。
18、可选地，所述dna片段的整合位点依次为ix-1、xi-8和ix-2。
19、可选地，所述嗜盐古菌haloferaxvolcanii型修饰的甲羟戊酸途径通过分别在染色体上整合dna片段得到；
20、所述dna片段依次为：tprm9-erg20-pgal10-1-cnvs-ttdh2、pgal7-idi1-tadh1-tprm9-erg10-pgal10-1-erg13-tcps1、tdit1-pmd-pgal10-1-erg12-tpdc1和tpyx212-hmgr-pgal10-1-ipk-tfba1。
21、可选地，所述dna片段的整合位点依次为xi-1、x-3、xi-7和xi-6。
22、所述嗜酸热原体古菌thermoplasmaacidophilum型修饰的甲羟戊酸途径通过分别在染色体上整合dna片段得到；
23、所述dna片段依次为：pgal2-m3k-tpyx212-tpdc1-bmd-pgal10-1-ipk-tfba1和tcps1-hmgr-pgal10-1-m3k5p-tcyc1。
24、可选地，所述dna片段的整合位点依次为xi-8和v-1。
25、可选地，所述嗜盐古菌haloferaxvolcanii型修饰的甲羟戊酸途径增加erg12和ipk拷贝数通过在染色体上整合dna片段得到；
26、所述dna片段为：tdit1-ipk-pgal10-1-erg12-tpdc1。
27、可选地，所述dna片段的整合位点为xi-2。
28、本专利技术在酿酒酵母过氧化物酶体中构建三条异戊二烯合成途径，包括嗜盐古菌haloferaxvolcanii型修饰的甲羟戊酸途径、嗜酸热原体古菌thermoplasmaacidophilum型修饰的甲羟戊酸途径和经典的甲羟戊酸途径，其中嗜酸热原体古菌thermoplasmaacidophilum型修饰的甲羟戊酸途径首次在酵母中构建。嗜盐古菌haloferaxvolcanii型修饰的甲羟戊酸途径首次在微生物细胞工厂中构建。嗜盐古菌haloferaxvolcan本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.基于酵母的合成倍半萜瓦伦烯的方法，其特征在于，所述方法包括：
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述嗜盐古菌Haloferaxvolcanii型修饰的甲羟戊酸途径基因分别为乙酰乙酰辅酶A硫酶ERG10、3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A合酶ERG13、3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶HMGR、甲羟戊酸激酶ERG12、磷酸甲羟戊酸脱羧酶PMD、异戊烯基磷酸激酶IPK和异戊烯基二磷酸异构酶IDI1；
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述嗜酸热原体古菌Thermoplasmaacidophilum型修饰的甲羟戊酸途径基因分别为乙酰乙酰辅酶A硫酶ERG10、3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A合酶ERG13、3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶HMGR、甲羟戊酸-3-磷酸激酶M3K、甲羟戊酸-3-磷酸5-激酶M3K5P、磷酸甲羟戊酸脱羧酶BMD和异戊烯基二磷酸异构酶IDI1；
4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述嗜盐古菌Haloferaxvolcanii型修饰的甲羟戊酸途径基因全部表达后，再增加ERG12和IPK拷贝数提高瓦伦
5.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述嗜盐古菌Haloferaxvolcanii型修饰的甲羟戊酸途径基因全部表达后，强化乙酰辅酶A到3-羟基-3-甲基戊二酸单酰辅酶A合成途径中的酶。
6.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述嗜盐古菌Haloferaxvolcanii型修饰的甲羟戊酸途径基因全部表达后，增加瓦伦烯合酶拷贝数和过氧化物酶体数量；
7.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述嗜盐古菌Haloferaxvolcanii型修饰的甲羟戊酸途径通过分别在染色体上整合DNA片段得到；
8.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述嗜酸热原体古菌Thermoplasmaacidophilum型修饰的甲羟戊酸途径通过分别在染色体上整合DNA片段得到；
9.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述嗜盐古菌Haloferaxvolcanii型修饰的甲羟戊酸途径增加ERG12和IPK拷贝数通过在染色体上整合DNA片段得到；
10.权利要求1～9任一项所述的方法得到的工程菌的至少一种在制备萜类化合物中的应用。
...【技术特征摘要】
1.基于酵母的合成倍半萜瓦伦烯的方法，其特征在于，所述方法包括：
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述嗜盐古菌haloferaxvolcanii型修饰的甲羟戊酸途径基因分别为乙酰乙酰辅酶a硫酶erg10、3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶a合酶erg13、3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶a还原酶hmgr、甲羟戊酸激酶erg12、磷酸甲羟戊酸脱羧酶pmd、异戊烯基磷酸激酶ipk和异戊烯基二磷酸异构酶idi1；
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述嗜酸热原体古菌thermoplasmaacidophilum型修饰的甲羟戊酸途径基因分别为乙酰乙酰辅酶a硫酶erg10、3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶a合酶erg13、3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶a还原酶hmgr、甲羟戊酸-3-磷酸激酶m3k、甲羟戊酸-3-磷酸5-激酶m3k5p、磷酸甲羟戊酸脱羧酶bmd和异戊烯基二磷酸异构酶idi1；
4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述嗜盐古菌haloferaxvolcanii型修饰的甲羟戊酸途径基因全部表达后，再增加erg12和ipk拷贝数提高瓦伦烯生物合成效...
【专利技术属性】
技术研发人员：周雍进，曹春阳，林心萍，张素芳，朱蓓薇，
申请(专利权)人：中国科学院大连化学物理研究所，
类型：发明
国别省市：
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