【技术实现步骤摘要】
本专利技术公开了一种质粒，属于核酸分子。
技术介绍
1、抗体（antibody, ab）是介导体液免疫的重要效应分子，是免疫系统在抗原刺激下，由b细胞或记忆b细胞增殖分化成的浆细胞所产生的、可与相应抗原发生特异性结合的免疫球蛋白（immunoglobulin, ig），主要分布在血清中，也分布于组织液、外分泌液及某些细胞膜表面。抗体重链分子量约为50~75 kda，由450~550个氨基酸残基组成，根据重链恒定区的差异可将其分为5类：μ链、γ链、α链、δ链和ε链，不同的重链与轻链组成完整的抗体分子，分别被称为igm、igg、iga、igd和ige。
2、iga有血清型和分泌型两种。血清型为单体，主要存在于血清中，占血清免疫球蛋白总量的10%~15%。分泌型iga（secretory iga, siga）为二聚体，由j链连接，含分泌成分（secretory component, sc），经黏膜上皮细胞分泌至外分泌液中。siga合成和分泌的部位主要在肠道、呼吸道、乳腺、唾液腺和泪腺，主要存在于胃肠道和支气管分泌液、初乳、唾液和泪液中。siga是外分泌液中的主要抗体类别，参与黏膜局部免疫，通过与相应病原微生物结合，阻止病原体黏附到细胞表面，从而在局部抗感染中发挥重要作用，是机体抗感染的“边防军”。siga在黏膜表面也有中和毒素的作用。新生儿易患呼吸道、胃肠道感染可能与iga合成不足有关。婴儿可从母亲初乳中获得siga，是重要的自然被动免疫。
3、人体中，iga分为iga1和iga2两种亚型，血清型iga大约90
4、2022年全球抗体药物市场规模达到2200亿美元，得益于至少125款抗体药物的销售贡献，适应症覆盖自身免疫性疾病、肿瘤、感染性疾病等领域。人工制备抗体是大量获得抗体的有效途径，随着分子生物学的发展，人们已可通过抗体工程技术制备基因工程抗体。抗体发现策略从杂交瘤技术，到噬菌体文库技术，到转基因鼠技术再到现在的单细胞pcr技术、单细胞测序技术，可获得天然配对的全人源抗体基因。现有的抗体治疗药物主要为igg型，近年来，iga作为一种新型的治疗性抗体受到越来越多的关注。尽管目前未有获批上市的iga药物，但是很多临床前研究表明，iga在黏膜抗感染、自身免疫疾病等领域展现出巨大的应用潜力，有望成为新的治疗手段。构建人源iga抗体重链表达质粒为治疗性iga药物的研究提供了快速便捷的方法。
5、本专利技术的目的是提供一种可以便捷、快速克隆表达人源iga抗体重链的质粒，进而提供以所述质粒表达人源iga抗体重链的方法。
技术实现思路
1、基于上述目的，本专利技术首先提供了一种人源iga抗体重链表达质粒，在所述人源iga抗体重链表达质粒依次含有抗生素抗性筛选基因、cmv启动子，携带kozak序列元件和抗体重链信号肽的抗体先导序列元件，连接元件，重链恒定区、转录后调节序列、polya尾，其中，在所述抗体先导序列元件的下游设置有 hpa i酶切位点，在重链恒定区的上游设置 ecorv酶切位点，所述连接元件位于 hpa i酶切位点和 ecor v酶切位点之间，所述人源iga抗体重链表达质粒经 hpa i和 ecor v双酶切致所述连接元件被去除后两个线性化末端用于分别与拟表达的人源iga抗体重链可变区编码基因5’端同源重组臂和人源iga抗体重链可变区编码基因3’端同源重组臂进行同源重组，所述人源iga抗体重链可变区编码基因5’端同源重组臂序列如seq id no.13 所示，所述人源iga抗体重链可变区编码基因3’端同源重组臂如seq id no.14 所示，所述抗体先导序列元件的序列如seq id no.4所示。
2、在一个优选的实施方案中，所述重链恒定区编码基因如seq id no.1 所示或如seq id no.2 所示。所述seq id no.1为iga1型的重链序列，具有该序列的人源iga抗体重链表达质粒被命名为：pab-igha1；所述seq id no.2为iga2型的重链序列，具有该序列的人源iga抗体重链表达质粒被命名为：pab-igha2。
3、在另一个优选的实施方案中，在所述重链恒定区和转录后调节序列之间设置有多克隆位点，所述多克隆位点的序列如seq id no.7所示。
4、在又一个优选的实施方案中，转录后调节序列为土拨鼠肝炎病毒转录后调节序列（genbank: mq208857.1）。
5、在一个优选的实施方案中，所述抗生素抗性筛选基因为氨苄青霉素抗性筛选基因。
6、在另一个优选的实施方案中，所述连接元件的序列如seq id no.5所示，在本专利技术中所述连接元件的设计用于酶切载体之前将抗体先导序列元件与重链恒定区连接保持质粒环形化，酶切后所述连接元件被释放，并回收线性化质粒回收。因此，连接元件的具体序列内容与本专利技术的人源iga抗体重链表达质粒的应用功能无关，只要能够履行上述功能的dna片段均可以作为本专利技术的连接元件使用。
7、其次，本专利技术提供了上述的人源iga抗体重链表达质粒的制备方法，所述方法包括以下步骤：
8、（1）构建含有抗生素抗性筛选基因、cmv启动子、转录后调节序列、polya尾和多克隆位点的真核细胞表达载体，所述真核细胞表达载体在本专利技术中被命名为pab；其中，在所述cmv启动子的下游设置 ecor i酶切位点，在转录后调节序列的上游设置 not i酶切位点，所述真核细胞表达载体经 ecor i和 not i双酶切后两个线性化末端用于同源重组；
9、（2）构建含有5’端同源重组臂、抗体先导序列元件，连接元件，重链恒定区和3’端同源重组臂的线性片段，其中，5’端同源重组臂中含有 ecor i酶切位点，3’端同源重组臂中含有 not i酶切位点，在所述抗体先导序列元件的下游设置有 hpa i酶切位点，在重链恒定区的上游设置 ecor v酶切位点；
10、（3）使用 ecor i和 本文档来自技高网...
【技术保护点】
1. 一种人源IgA抗体重链表达质粒，其特征在于，在所述人源IgA抗体重链表达质粒依次含有抗生素抗性筛选基因、CMV启动子，携带Kozak序列元件和抗体重链信号肽的抗体先导序列元件，连接元件，重链恒定区、转录后调节序列、polyA尾，其中，在所述抗体先导序列元件的下游设置有Hpa I酶切位点，在重链恒定区的上游设置EcoRV酶切位点，所述连接元件位于Hpa I酶切位点和EcoRV酶切位点之间，所述人源IgA抗体重链表达质粒经Hpa I和EcoRV双酶切致所述连接元件被去除后，两个线性化末端用于分别与拟表达的人源IgA抗体重链可变区编码基因5’端同源重组臂和人源IgA抗体重链可变区编码基因3’端同源重组臂进行同源重组，所述人源IgA抗体重链可变区编码基因5’端同源重组臂序列如SEQ IDNO.13 所示，所述人源IgA抗体重链可变区编码基因3’端同源重组臂如SEQ ID NO.14 所示，所述抗体先导序列元件的序列如SEQ ID NO.4所示。
2. 根据权利要求1所述的人源IgA抗体重链表达质粒，其特征在于，所述重链恒定区编码基因如SEQ ID NO.1 所示或如SE
3. 根据权利要求1所述的人源IgA抗体表达质粒系统，其特征在于，在所述重链恒定区和转录后调节序列之间设置有多克隆位点，所述多克隆位点的序列如SEQ ID NO.7所示。
4.根据权利要求1所述的人源IgA抗体重链表达质粒，其特征在于，转录后调节序列为土拨鼠肝炎病毒转录后调节序列。
5.根据权利要求1所述的人源IgA抗体重链表达质粒，其特征在于，所述抗生素抗性筛选基因为氨苄青霉素抗性筛选基因。
6. 根据权利要求1所述的人源IgA抗体重链表达质粒，其特征在于，所述连接元件的序列如SEQ ID NO. 5所示。
7.权利要求1-6任一所述的人源IgA抗体重链表达质粒的制备方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
8. 根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于，步骤（2）中所述5’端同源重组臂的序列如SEQ ID NO.3 所示，所述3’端同源重组臂的序列如SEQ ID NO. 6所示。
9. 根据权利要求8所述的制备方法，其特征在于，步骤（2）中所述线性片段的序列如SEQ ID NO.8 所示或如SEQ ID NO.9 所示。
10.一种应用权利要求1-6任一所述的人源IgA抗体重链表达质粒制备人源IgA抗体重链的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
11. 根据权利要求10所述的制备方法，其特征在于，通过PCR扩增构建步骤（2）所述的人源IgA抗体的重链可变区线性片段，其中，在所述PCR扩增的上游引物由5’端同源重组臂与重链可变区特异结合区两个区段串联而成，在所述PCR扩增的下游引物设置为3’端同源重组臂与重链可变区特异结合区两个区段串联而成，所述PCR扩增的上游引物的5’端的同源重组臂的序列如SEQ ID NO.13 所示，所述PCR扩增的下游引物的5’端的同源重组臂的序列如SEQ ID NO.14所示。
12.一种制备人源IgA抗体重链的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括：
...【技术特征摘要】
1. 一种人源iga抗体重链表达质粒，其特征在于，在所述人源iga抗体重链表达质粒依次含有抗生素抗性筛选基因、cmv启动子，携带kozak序列元件和抗体重链信号肽的抗体先导序列元件，连接元件，重链恒定区、转录后调节序列、polya尾，其中，在所述抗体先导序列元件的下游设置有hpa i酶切位点，在重链恒定区的上游设置ecorv酶切位点，所述连接元件位于hpa i酶切位点和ecorv酶切位点之间，所述人源iga抗体重链表达质粒经hpa i和ecorv双酶切致所述连接元件被去除后，两个线性化末端用于分别与拟表达的人源iga抗体重链可变区编码基因5’端同源重组臂和人源iga抗体重链可变区编码基因3’端同源重组臂进行同源重组，所述人源iga抗体重链可变区编码基因5’端同源重组臂序列如seq idno.13 所示，所述人源iga抗体重链可变区编码基因3’端同源重组臂如seq id no.14 所示，所述抗体先导序列元件的序列如seq id no.4所示。
2. 根据权利要求1所述的人源iga抗体重链表达质粒，其特征在于，所述重链恒定区编码基因如seq id no.1 所示或如seq id no.2所示。
3. 根据权利要求1所述的人源iga抗体表达质粒系统，其特征在于，在所述重链恒定区和转录后调节序列之间设置有多克隆位点，所述多克隆位点的序列如seq id no.7所示。
4.根据权利要求1所述的人源iga抗体重链表达质粒，其特征在于，转录后调节序列为土拨鼠肝炎病毒转录后调节序列。
5.根据权利要求1所述的人源iga...
【专利技术属性】
技术研发人员：张冠英，于长明，黄平，李建民，迟象阳，孙韩聪，房婷，范鹏飞，陈郑珊，陈薇，
申请(专利权)人：中国人民解放军军事科学院军事医学研究院，
类型：发明
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