【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生物化工领域，具体涉及一种分别利用d-木糖和d-葡萄糖全细胞催化合成d-核糖和d-阿洛糖的方法。
技术介绍
1、d-核糖是一种简单的含有5个碳原子的单糖或戊糖，是生物体内遗传物质——核糖核酸(rna)的重要组成物质，d-核糖存在于所有细胞中，是核苷酸、多种辅酶和遗传物质核酸的重要组成成分，也是能量物质三磷酸腺苷(atp)的结构成分，具有重要的生理功能和应用前景。d-核糖已广泛应用于医药、食品饮料、营养保健、临床营养等领域。在医药领域，d-核糖是多种核苷类、抗肿瘤等多种药物的重要中间体和起始原料，目前临床使用的抗病毒药物中近50％是核苷类药物，比如卡培他滨、替卡格雷和瑞德西韦，均使用d-核糖作中间体和起始原料。在食品应用领域，d-核糖能够合成新型食品添加剂呈味核苷酸，呈味核苔酸可作为一种营养品,可作食品添加剂为提高身体素质提供核心物质基础。在临床营养和体育运动营养方面，d-核糖已广泛应用于临床营养(心脏病患者辅助治疗、肌纤维疼痛综合症)、抗高原缺氧等产品上。d-核糖在体育运动营养方面具有抗疲劳、耐缺氧的作用。
2、合成d-核糖的最早方法涉及酶水解，或从葡萄糖、阿拉伯糖、葡糖酸和木糖化学合成，但是这些方法存在成本高、转化率很低、纯化复杂、易造成环境污染等不足，因此没有取得太大的商业成功。d-核糖的生物合成发生在戊糖磷酸途径(ppp)中。转酮醇酶基因tkt的缺失会导致d-核糖在多种微生物中积累，包括酿酒酵母、大肠杆菌、短小芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌。ppp途径发酵副产物多，合成d-核糖需要消耗atp，产品难分离，
3、d-阿洛糖具有低热量、低吸收、抗龋齿、降血糖、改善肠道菌群及良好的理化性质等优点。d-阿洛糖被发现具有很强的抗氧化和抗炎特性，可能有助于预防和治疗多种疾病。此外，d-阿洛糖已被发现具有潜在的抗癌特性，并已被研究其抑制癌细胞生长的能力。d-阿洛糖还被发现可以抵抗氧化应激，改善心血管健康。d-阿洛糖对叶状中性粒细胞有重要抑制作用，且无其它有害副作用，这就意味着d-阿洛糖可能能够作为器官和组织移植后的一种免疫抑制剂。d-阿洛糖还是合成lna(锁核酸)单体、阿洛糖醇和氟代糖的重要原料，其应用领域涉及核苷类抗艾滋病、抗癌和抗真菌药物等。
4、d-阿洛糖的合成途径有化学法和生物法，其中化学法通常会产生多种副产物，对产生的废弃物进行无害化处理也是一个挑战，相比之下，生物合成具有专一性高、条件温和、环境友好等优点，符合绿色制造的理念。目前，大多数关于d-阿洛糖生物生产的研究是基于izumoring酶促级联作为通过单糖之间的酶催化差向异构化合成稀有糖的策略。虽然可逆差向异构化导致底物转化率低，但该方法仍是制备稀有糖的最佳选择，并已成功应用于d-果糖合成d-阿洛酮糖的工业生产中。
技术实现思路
1、有鉴于此，本专利技术的目的在于提供一种分别利用d-葡萄糖和d-木糖制备d-核糖和d-阿洛糖的方法，利用d-葡萄糖异构酶(accegi，seq id no:1)、d-阿洛酮糖-3-差向异构酶(ccdpease，seq id no:2)、l-鼠李糖异构酶(bs-l-rhi，seq id no:3)，构建共表达质粒，构建出产d-核糖和d-阿洛糖的工程菌，从而实现分别以廉价底物d-木糖和d-葡萄糖直接合成d-核糖和d-阿洛糖。
2、为了实现上述专利技术目的，本专利技术提供以下技术方案：
3、本专利技术提供了一种分别利用d-木糖和d-葡萄糖全细胞合成d-核糖和d-阿洛糖的方法，所述d-核糖和d-阿洛糖合成方法以大肠杆菌为底盘细胞，构建全细胞催化剂将d-木糖转化为d-核糖，将d-葡萄糖转化为d-阿洛糖。
4、可选的，所述的大肠杆菌为大肠杆菌bl21(de3)。
5、可选的，所述的全细胞催化剂构建方法如下：将来源于acidothermuscellulolyticus 11b的d-葡萄糖异构酶编码基因(accegi,seq id no:1)和来源于clostridium cellulolyticum h10的d-阿洛酮糖-3-差向异构酶编码基因(ccdpease,seqid no:2)分别使用一步克隆试剂盒(南京诺唯赞生物科技股份有限公司)克隆到载体pet28a(pb)的bamhi和hindiii位点之间得到重组质粒pet28a(pb)n-ccdpease-accegi；pcr扩增异构酶编码基因：(bs-l-rhi,seq id no:6)，用nhei消化pet28a(pb)-ccdpease-accegi，用dpni消化(bs-l-rhi，seq id no:6)，将上述消化后的(bs-l-rhi，seq id no:6)使用一步克隆试剂盒(南京诺唯赞生物科技股份有限公司)克隆到载体pet28a(pb)-ccdpease-accegi的nhei位点(所用引物见表1)得到重组质粒pet28a(pb)n-ccdpease-accegi-bs-l-rhi(如图2所示)。将重组质粒转化至大肠杆菌bl21(de3)中，即得到重组大肠杆菌bl21/pet28a(pb)n-ccdpease-accegi-bs-l-rhi。该重组菌株可用于制备全细胞催化剂，将d-木糖合成为d-核糖，将d-葡萄糖转化为d-阿洛糖。
6、可选的，上述重组菌株bl21/pet28a(pb)n-ccdpease-accegi-bs-l-rhi将d-木糖和d-葡萄糖分别转化为d-核糖和d-阿洛糖的条件为：将重组菌株在lb培养基中37℃、200rpm条件下培养过夜，以2％(v/v)的接种量转接到装有25ml新鲜lb培养基的250ml三角瓶中，37℃、200rpm条件下培养至对数期。添加终浓度为500μm的iptg，在25℃、200rpm条件下继续培养12h。将上述诱导后的体系在4℃、4000rpm条件下离心5min，收集菌体，使用灭菌的超纯水洗涤菌体去除培养基，然后使用20mm、ph为7.5的磷酸盐缓冲液(pbs)重悬菌体，即得到静息细胞，可作为全细胞催化剂用于后续反应。
7、可选的，所述的d-葡萄糖50g/l、d-木糖50g/l。
8、可选的，所述的转化条件为65℃反应4-36h。
9、相比于现有的技术，本专利技术具有以下有益效果：
10、(1)本专利技术使用廉价的原料d-葡萄糖和d-木糖作为底物，大大降低了d-核糖和d-阿洛糖的生产成本，适合大规模生产。
11、(2)本专利技术相比于磷酸戊糖途径生产d-核糖，反应过程单一，且不消耗能量，反应副产物少，便于后续的分离纯化。
12、(3)全细胞转化相较于酶法催化，避免了繁琐的酶的纯化步骤及辅因子等一系列问题，且反应条件温和，更加适合工业化生产。
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1.一种分别利用D-木糖和D-葡萄糖全细胞催化合成D-核糖和D-阿洛糖的方法。其特征在于，分别以D-木糖和D-葡萄糖为底物，以大肠杆菌为底盘细胞，利用D-葡萄糖异构酶(AcceGI，SEQ ID NO:1)、D-阿洛酮糖-3-差向异构酶(CcDPEase，SEQ ID NO:2)、L-鼠李糖异构酶(Bs-L-RhI，SEQ ID NO:3)，将D-木糖和D-葡萄糖分别转化为D-核糖和D-阿洛糖(反应过程如图1所示)。
2.根据权利要求1所述的转化途径，其特征在于(1)来源于Acidothermuscellulolyticus 11B的D-葡萄糖异构酶编码基因(AcceGI,SEQ ID NO:4)；(2)来源于Clostridium cellulolyticum H10的D-阿洛酮糖-3-差向异构酶编码基因(CcDPEase,SEQID NO:5)；(3)来源于Bacillus subtilis 168的L-鼠李糖异构酶编码基因(Bs-L-RhI,SEQID NO:6)。
3.根据权利要求1所述的D-核糖合成方法，其特征在于，以质粒pET28a(PB)N(
4.根据权利要求1、权利要求3，以大肠杆菌BL21(DE3)为表达宿主，将重组质粒转化到大肠杆菌BL21(DE3)中，得到含有所有途径基因的工程菌株BL21/pET28a(PB)N-CcDPEase-AcceGI-Bs-L-RhI。
5.根据权利要求1所述的D-核糖和D-阿洛糖全细胞合成方法和权利要求4所述的重组工程菌株，其特征在于，所使用的转化条件如下：(1)在LB培养基中，培养大肠杆菌重组工程菌至OD600＝0.6-0.8，添加终浓度为0.5mM的异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)，在25℃，200rpm条件下诱导基因表达12h；(2)在4℃，4000rpm条件下离心收集菌体，使用灭菌的超纯水洗涤菌体去除培养基，然后使用20mM、pH为7.5的磷酸盐缓冲液(PBS)重悬菌体，即得到静息细胞；(3)分别以D-木糖和D-葡萄糖作为底物，添加终浓度为1mM CoCl2和20mM MgCl2作为催化离子，65℃反应4-36h；(4)使用离子色谱仪分别分析D-核糖和D-阿洛糖的产量。
6.根据权利要求1和权利要求5，工程菌株BL21/pET28a(PB)N-CcDPEase-AcceGI-Bs-L-RhI能分别催化50g/L D-木糖生成6.6g/L D-核糖，50g/L D-葡萄糖生成4.19g/L D-阿洛糖。
...【技术特征摘要】
1.一种分别利用d-木糖和d-葡萄糖全细胞催化合成d-核糖和d-阿洛糖的方法。其特征在于，分别以d-木糖和d-葡萄糖为底物，以大肠杆菌为底盘细胞，利用d-葡萄糖异构酶(accegi，seq id no:1)、d-阿洛酮糖-3-差向异构酶(ccdpease，seq id no:2)、l-鼠李糖异构酶(bs-l-rhi，seq id no:3)，将d-木糖和d-葡萄糖分别转化为d-核糖和d-阿洛糖(反应过程如图1所示)。
2.根据权利要求1所述的转化途径，其特征在于(1)来源于acidothermuscellulolyticus 11b的d-葡萄糖异构酶编码基因(accegi,seq id no:4)；(2)来源于clostridium cellulolyticum h10的d-阿洛酮糖-3-差向异构酶编码基因(ccdpease,seqid no:5)；(3)来源于bacillus subtilis 168的l-鼠李糖异构酶编码基因(bs-l-rhi,seqid no:6)。
3.根据权利要求1所述的d-核糖合成方法，其特征在于，以质粒pet28a(pb)n(序列如seq id no:7)为上述转化途径的表达载体，构建出含有所有途径基因的重组质粒pet28a(pb)n-ccdpease-accegi-bs-l-rhi。
...【专利技术属性】
技术研发人员：吕永坤，许敬亮，董寒玉，赵安琪，熊文龙，张申，阿拉牧，
申请(专利权)人：郑州大学，
类型：发明
国别省市：
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