【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生物，尤其是涉及一种牛疱疹病毒4型抗原、制备方法和应用。
技术介绍
1、牛疱疹病毒(bovine herpesvirus bhv-4)是丙型疱疹病毒科的新成员，首次从匈牙利患有呼吸系统疾病和结膜炎的犊牛身上分离出。后来相继从外表健康的和患有流产、子宫炎、肺炎、腹泻、呼吸道感染、乳房炎、脓泡性皮炎等牛的不同组织和细胞内分离出该病毒。现在bhv-4已蔓延世界各地，而该病多为牛的隐性感染，和其他病原共同感染牛后可能使临床症状加剧，且表现多样化，给诊断和治疗带来较大困难，对养牛业构成严重威胁。国外对bhv-4的形态结构、致病性、免疫及分子生物学等方面的研究已取得很大进展。
2、bhv-4病毒基因组为1446kb的双股线形dna分子。糖蛋白gb蛋白是在病毒膜上最丰富的蛋白之一，其编码基因是疱疹病毒科成员中最保守的一个基因。bhv-4gb是异二聚体，由orf8(11420nt～14044nt)编码874个氨基酸，被蛋白水解酶切割成2个分别为51ku和46ku的亚体组成了分子的氨基端和羧基端，但仍以二硫键相连。两个亚体分别具有15个、5个与n端连接的糖基化位点。gb基因作为bhv-4病毒粒子的重要组成部分在病毒复制中发挥重要作用，也是刺激机体产生抗体的主要糖蛋白之一。
3、疱疹病毒gb和gd蛋白能够诱导中和抗体，是目前研究疫苗的靶蛋白。据有关报道，猪伪狂犬gb、gd亚单位疫苗有很好的免疫原性、牛传染性鼻气管炎病毒gd蛋白亚单位疫苗也有很好的免疫原性，bhv-4也属于疱疹病毒科，但bhv-4无gd蛋白，据文
4、有鉴于此，特提出本专利技术。
技术实现思路
1、本专利技术的第一个目的在于提供牛疱疹病毒4型gb蛋白，该蛋白免疫原性好，蛋白表达量高。
2、本专利技术的第二个目的在于提供上述牛疱疹病毒4型gb蛋白的制备方法。
3、本专利技术的第三个目的在于提供一种牛疱疹病毒4型gb蛋白亚单位疫苗。
4、本专利技术的第四个目的在于提供上述牛疱疹病毒4型gb蛋白在制备牛疱疹病毒4型亚单位疫苗及相关诊断试剂中的应用。
5、第一方面，本专利技术提供了牛疱疹病毒4型gb蛋白，编码所述gb蛋白的核苷酸序列如seq id no:1所示。
6、作为进一步技术方案，所述gb蛋白由cho细胞表达。
7、第二方面，本专利技术提供了一种牛疱疹病毒4型gb蛋白的制备方法，所述制备方法包括：将所述的牛疱疹病毒4型gb蛋白的核苷酸插入到pee12.4载体上，并在其下游插入6×his标签，得到重组质粒pee12.4-gb质粒。
8、进一步地，将所述重组质粒pee12.4-gb质粒转染至cho细胞，获得cho-gb细胞株。
9、进一步地，培养获得的cho-gb细胞株，收获上清纯化后获得所述牛疱疹病毒4型gb蛋白抗原。
10、作为进一步技术方案，所述cho-gb细胞株培养步骤为：使用60％dynamis+40％ex-cell 302培养基培养，在37℃条件下培养至第6日时，降温至32～34℃，继续培养至第10-15天收获gb蛋白抗原。
11、进一步地，所述cho-gb细胞株在37℃培养至第6日时，降温至33℃，继续培养至第15天收获gb蛋白抗原。
12、进一步地，所述cho-gb细胞株培养转速为30～100r/min，ph值为7.0～7.4、do值为20～100。
13、优选地，所述cho-gb细胞株培养转速为55r/min，ph值为7.2、do值为40。
14、作为进一步技术方案，所述培养到第6日添加补料培养基cd efficient feed c培养，添加体积为原培养基的5％～15％。
15、优选地，所述补料培养基添加体积为原培养基的10％。
16、作为进一步技术方案，所述培养过程中全程控制葡萄糖浓度，使葡萄糖浓度维持在2.0～3.0g/l。
17、优选地，所述培养过程中葡萄糖浓度始终维持为2.5g/l。
18、进一步地，将所述培养物离心，收集离心上清液，用镍柱纯化得到所述牛疱疹病毒4型gb蛋白；
19、优选地，所述离心条件为4℃，10000r/min离心30分钟。
20、第三方面，本专利技术提供一种牛疱疹病毒4型gb蛋白亚单位疫苗，包括上述牛疱疹病毒4型gb蛋白。
21、进一步地，所述疫苗中牛疱疹病毒4型gb蛋白的含量为80～250μg/ml。
22、优选地，所述牛疱疹病毒4型gb蛋白的含量为80μg/ml。
23、作为进一步技术方案，所述牛疱疹病毒4型gb蛋白亚单位疫苗中还包括佐剂。
24、进一步地，gb蛋白抗原和佐剂的质量比为1:1。
25、优选地，所述佐剂为双向佐剂，进一步优选为isa 206 vg佐剂。
26、第四方面，本专利技术提供了上述牛疱疹病毒4型gb蛋白在制备牛疱疹病毒4型亚单位疫苗及相关诊断试剂中的应用。
27、与现有技术相比，本专利技术具有如下有益效果：
28、本专利技术提供的牛疱疹病毒4型gb蛋白表达量高、免疫原性好，能够有效诱导机体产生相应抗体，适于制备用于预防牛疱疹病毒4型的产品。
29、本专利技术提供的牛疱疹病毒4型gb蛋白的制备方法，降低了杂蛋白的产量，提高了目的蛋白的表达量，该方法操作简单，稳定、高效且质量可控。
30、本专利技术提供的牛疱疹病毒4型亚单位疫苗，以上述gb蛋白为活性物质，其安全性好，能够有效的激发机体的免疫反应，免疫效果好，副作用小。
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1.牛疱疹病毒4型gB蛋白，其特征在于，编码所述gB蛋白的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。
2.根据权利要求1所述的gB蛋白，其特征在于，所述蛋白由CHO细胞表达。
3.如权利要求1所述gB蛋白的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括：
4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述培养步骤(3)具体为：CHO-gB细胞株在37℃下培养至第6日时，降温至32～34℃，继续培养至第10-15天收获gB蛋白抗原；
5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，使用60％Dynamis+40％EX-CELL 302培养基培养，培养第6日添加补料培养基CD Efficient Feed C，所述补料培养基的添加体积为原培养基的5％～15％。
6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述补料培养基的添加体积为原培养基的10％。
7.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，培养过程中控制葡萄糖的浓度，使葡萄糖浓度维持在2.0～3.0g/L，优选地，所述葡萄糖浓度维持在2.5g/L。
8.一
9.根据权利要求7所述的疫苗，其特征在于，所述疫苗中牛疱疹病毒4型gB蛋白的含量为80～250μg/mL；优选地，所述牛疱疹病毒4型gB蛋白的含量为80μg/mL。
10.如权利要求1-8中任一项所述的牛疱疹病毒4型gB蛋白在制备牛疱疹病毒4型亚单位疫苗及相关诊断试剂中的应用。
...【技术特征摘要】
1.牛疱疹病毒4型gb蛋白，其特征在于，编码所述gb蛋白的核苷酸序列如seq id no:1所示。
2.根据权利要求1所述的gb蛋白，其特征在于，所述蛋白由cho细胞表达。
3.如权利要求1所述gb蛋白的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括：
4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述培养步骤(3)具体为：cho-gb细胞株在37℃下培养至第6日时，降温至32～34℃，继续培养至第10-15天收获gb蛋白抗原；
5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，使用60％dynamis+40％ex-cell 302培养基培养，培养第6日添加补料培养基cd efficient feed c，所述补料培养基的添加体积为原培养基的5％～15％。...
【专利技术属性】
技术研发人员：贺笋，杜久斌，
申请(专利权)人：天康生物制药有限公司，
类型：发明
国别省市：
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