【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本公开提供了细胞外囊泡(ev)(例如，外泌体)，其可以用作防治或治疗癌症和其他疾病的药剂，其包括至少一种经由优化的接头(linker)和锚定部分连接到细胞外囊泡(例如，外泌体)的生物活性分子。
技术介绍
1、很多生物活性化合物具有有治疗意义的有效生物活性。然而，这些化合物通常在非靶标器官中表现出毒性。限制非靶标组织暴露的一种方式是将小分子化学缀合至基于亲和力的试剂(例如抗体)，其可以将治疗性化合物引导至特定的细胞类型(dosio,f.et al.,toxins(basel)3(7):848-883(2011))，但这种方法受到可以连接到抗体上的感兴趣化合物的分子数量(通常每个抗体2-6个分子)的限制，以及受到特异性结合到被靶向的相关患病/效应细胞而不结合到非靶标细胞的抗体的可用性/存在的限制。这两个问题分别通过降低效力和增加全身毒性来限制抗体-药物缀合物(adc)的使用。因此，需要具有比adc更高的有效负载(payload)的递送系统，其可以选择性地靶向特定组织或器官，同时限制治疗性化合物的总体全身暴露。
2、ev(例如，外泌体)是细胞间通讯的重要介质。它们也是许多疾病(例如癌症)的诊断和预后的重要生物标志物。作为药物递送载体，ev(例如，外泌体)在许多治疗领域作为一种新的治疗模式，提供了许多优于传统药物递送方法(例如，肽免疫、dna疫苗)的优势。然而，尽管有其优点，许多ev(例如，外泌体)的临床效力有限。例如，在不能手术的非小细胞肺癌(nsclc)患者的一线化疗后，将树枝状细胞来源的外泌体(dex)在ii期临床试验
3、因此，需要新的、更有效的工程化ev(例如，外泌体)，以更好地实现基于ev的技术的治疗用途和其他应用。
技术实现思路
1、本公开提供了一种细胞外囊泡(ev)，其包括经由根据式：[am]-l1-[sp1]-l2-[sp2]-l3-[bam](式1)的锚定部分(am)共价连接到ev的生物活性分子(bam)，其中：[am]是锚定部分；l1是可裂解或不可裂解的键联(linkage)；l2和l3是可选的可裂解或不可裂解的键联；sp1是可选的第一间隔子(spacer)；以及，sp2是可选的第二间隔子。
2、在一些方面，锚定部分[am]包含固醇(sterol)、脂质、维生素、肽、或其组合以及可选地间隔子。在一些方面，可选的间隔子是烷基间隔子。在一些方面，烷基间隔子是c1、c2、c3、c4、c5、c6、c7、c8、c9、c10、c11、c12、c13、c14或c15。在一些方面，烷基间隔子是c6或c8。在一些方面，可选的间隔子是甘醇间隔子。在一些方面，甘醇间隔子具有2(二甘醇)、3(三甘醇)、4(四甘醇；teg)、5(五甘醇)、6(六甘醇；heg)、7、8、9、10、11、12、13、14或15个甘醇单元。在一些方面，甘醇间隔子是四甘醇(teg)。
3、在一些方面，固醇选自由胆固醇、麦角固醇、7-脱氢胆固醇、24s-羟基胆固醇、羊毛固醇、环阿屯醇、岩藻固醇、大褐马尾藻固醇(saringosterol)、菜油固醇、β-谷固醇、谷甾烷醇、粪固醇、燕麦固醇和豆固醇组成的组。在一些方面，固醇是胆固醇。在一些方面，脂质是脂肪酸。在一些方面，脂肪酸是直链脂肪酸。在一些方面，脂肪酸是直链脂肪酸、支链脂肪酸、不饱和脂肪酸、单不饱和脂肪酸、多不饱和脂肪酸、羟基脂肪酸、多元羧酸、或其任何组合。在一些方面，直链脂肪酸是丁酸、己酸、辛酸、癸酸、月桂酸、肉豆蔻酸、棕榈酸或硬脂酸。在一些方面，直链脂肪酸是棕榈酸。在一些方面，维生素是维生素e(生育酚或生育三烯酚)、维生素d、维生素k、核黄素(riboflavin)、烟酸或吡哆醇(pyridoxine)。在一些方面，维生素是维生素e(生育酚或生育三烯酚)。
4、在一些方面，l1是包含磷酸二酯键的可裂解的键联或包含硫代磷酸酯键的不可裂解的键联。在一些方面，l2是可选的包含磷酸二酯酶键的可裂解的键联或包含硫代磷酸酯键的不可裂解的键联。在一些方面，l3是可选的包含磷酸二酯酶键的可裂解的键联或包含硫代磷酸酯键的不可裂解的键联。在一些方面，sp1可选的第一间隔子和/或sp2可选的第二间隔子独立地包括烷基间隔子、甘醇间隔子、或其组合。在一些方面，烷基间隔子是c1、c2、c3、c4、c5、c6、c7、c8、c9、c10、c11、c12、c13、c14或c15。在一些方面，烷基间隔子是c3或c6。在一些方面，甘醇间隔子具有2(二甘醇)、3(三甘醇)、4(四甘醇；teg)、5(五甘醇)、6(六甘醇；heg)、7、8、9、10、11、12、13、14或15个甘醇单元。在一些方面，甘醇间隔子是四甘醇(teg)或六甘醇(heg)。在一些方面，每个不可裂解的间隔子独立地选自烷基、二甘醇、三甘醇、四甘醇(teg)、六甘醇(heg)、五甘醇、聚乙二醇(peg)、甘油、二甘油、三甘油、四甘油(tg)、五甘油、六甘油(hg)、聚甘油(pg)、琥珀酰亚胺、马来酰亚胺、或其任何组合。在一些方面，聚乙二醇(peg)的特征在于式r1-(o-ch2-ch2)n-或r1-(o-ch2-ch2)n-o-，其中r1是氢、甲基或乙基，并且n是1至15之间的整数。在一些方面，聚甘油(pg)的特征在于式((r1—o—(ch2—choh—ch2o)n—)，其中r1是氢、甲基或乙基，并且n是1至15之间的整数。
5、在一些方面，l1、l2或l3可裂解的键联或其任何组合包括氧化还原可裂解的接头、活性氧可裂解的接头、ph依赖性可裂解的接头、酶可裂解的接头、蛋白酶可裂解的接头、酯酶可裂解的接头、磷酸酶可裂解的接头、光活化的可裂解的接头、自分解性的接头、或其任何组合。在一些方面，l1、l2或l3可裂解的键联或其任何组合包括自分解性的接头。在一些方面，l1、l2或l3可裂解的键联或其任何组合包括肉桂基、萘基、联苯基、杂环、同源芳族、香豆素、呋喃、噻吩、噻唑、噁唑、异噁唑、吡咯、吡唑、吡啶、咪唑酮、三唑、或其任何组合。
6、在一些方面，l1、l2或l3可裂解的键联或其任何组合具有式：-aa-yy-，其中每个–a-独立地是氨基酸单元或其组合，a独立地是1至15的整数；-y-是间隔子单元，并且y是0、1或2。在一些方面，-aa-是二肽、三肽、四肽、五肽或六肽、或其组合，其中组合中的每个二肽、三肽、四肽、五肽或六肽可以相同或不同。在一些方面，a是2，并且–aa-是选自由缬氨酸-丙氨酸、缬氨酸-瓜氨酸、苯丙氨酸-赖氨酸、n-甲基缬氨酸-瓜氨酸、环己基丙氨酸-赖氨酸、谷氨酸-缬氨酸-瓜氨酸、和β-丙氨酸-赖氨酸组成的组。在一些方面，–aa-是缬氨酸-丙氨酸、缬氨酸-瓜氨酸、或谷氨酸-缬氨酸-瓜氨酸。在一些方面，y是1。在一些方面，-y-是自分解性的间隔本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种细胞外囊泡(EV)，其包括根据下式经由锚定部分(AM)与EV共价连接的生物活性分子(BAM)：
2.根据权利要求1所述的细胞外囊泡，其中所述锚定部分[AM]包含固醇、脂质、维生素、肽、或其组合以及可选地间隔子。
3.根据权利要求2所述的细胞外囊泡，其中所述可选的间隔子是烷基间隔子。
4.根据权利要求3所述的细胞外囊泡，其中所述烷基间隔子是C1、C2、C3、C4、C5、C6、C7、C8、C9、C10、C11、C12、C13、C14或C15。
5.根据权利要求3所述的细胞外囊泡，其中所述烷基间隔子是C6或C8。
6.根据权利要求2所述的细胞外囊泡，其中所述可选的间隔子是甘醇间隔子。
7.根据权利要求5所述的细胞外囊泡，其中所述甘醇间隔子具有2(二甘醇)、3(三甘醇)、4(四甘醇；TEG)、5(五甘醇)、6(六甘醇；HEG)、7、8、9、10、11、12、13、14或15个甘醇单元。
8.根据权利要求5所述的细胞外囊泡，其中所述甘醇间隔子是四甘醇(TEG)。
9.根据权利要求2所述的
10.根据权利要求2所述的细胞外囊泡，其中所述固醇是胆固醇。
11.根据权利要求2所述的细胞外囊泡，其中所述脂质是脂肪酸。
12.根据权利要求11所述的细胞外囊泡，其中所述脂肪酸是直链脂肪酸。
13.根据权利要求11所述的细胞外囊泡，其中所述脂肪酸是直链脂肪酸、支链脂肪酸、不饱和脂肪酸、单不饱和脂肪酸、多不饱和脂肪酸、羟基脂肪酸、多元羧酸、或其任何组合。
14.根据权利要求12所述的细胞外囊泡，其中所述直链脂肪酸是丁酸、己酸、辛酸、癸酸、月桂酸、肉豆蔻酸、棕榈酸或硬脂酸。
15.根据权利要求12所述的细胞外囊泡，其中所述直链脂肪酸是棕榈酸。
16.根据权利要求2所述的细胞外囊泡，其中所述维生素是维生素E(生育酚或生育三烯酚)、维生素D、维生素K、核黄素、烟酸或吡哆醇。
17.根据权利要求2所述的细胞外囊泡，其中所述维生素是维生素E(生育酚或生育三烯酚)。
18.根据权利要求1-17中任一项所述的细胞外囊泡，其中L1是包含磷酸二酯键的可裂解的键联或包含硫代磷酸酯键的不可裂解的键联。
19.根据权利要求1-18中任一项所述的细胞外囊泡，其中L2是可选的包含磷酸二酯键的可裂解的键联或包含硫代磷酸酯键的不可裂解的键联。
20.根据权利要求1-19中任一项所述的细胞外囊泡，其中L3是可选的包含磷酸二酯键的可裂解的键联或包含硫代磷酸酯键的不可裂解的键联。
21.根据权利要求1-20中任一项所述的细胞外囊泡，其中SP1可选的第一间隔子和/或SP2可选的第二间隔子独立地包括烷基间隔子、甘醇间隔子、或其组合。
22.根据权利要求21所述的细胞外囊泡，其中所述烷基间隔子是C1、C2、C3、C4、C5、C6、C7、C8、C9、C10、C11、C12、C13、C14或C15。
23.根据权利要求21所述的细胞外囊泡，其中所述烷基间隔子是C3或C6。
24.根据权利要求21所述的细胞外囊泡，其中所述甘醇间隔子具有2(二甘醇)、3(三甘醇)、4(四甘醇；TEG)、5(五甘醇)、6(六甘醇；HEG)、7、8、9、10、11、12、13、14或15个甘醇单元。
25.根据权利要求21所述的细胞外囊泡，其中所述甘醇间隔子是四甘醇(TEG)或六甘醇(HEG)。
26.根据权利要求1至25中任一项所述的细胞外囊泡，其中每个不可裂解的间隔子独立地选自烷基、二甘醇、三甘醇、四甘醇(TEG)、六甘醇(HEG)、五甘醇、聚乙二醇(PEG)、甘油、二甘油、三甘油、四甘油(TG)、五甘油、六甘油(HG)、聚甘油(PG)、琥珀酰亚胺、马来酰亚胺、或其任何组合。
27.根据权利要求26所述的细胞外囊泡，其中所述聚乙二醇(PEG)的特征在于式R1-(O-CH2-CH2)n-或R1-(O-CH2-CH2)n-O-，其中R1是氢、甲基或乙基，并且n是1至15之间的整数。
28.根据权利要求26所述的细胞外囊泡，其中所述聚甘油(PG)的特征在于式((R1—O—(CH2—CHOH—CH2O)n—)，其中R1是氢、甲基或乙基，并且n是1至15之间的整数。
29.根据权利要...
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】
1.一种细胞外囊泡(ev)，其包括根据下式经由锚定部分(am)与ev共价连接的生物活性分子(bam)：
2.根据权利要求1所述的细胞外囊泡，其中所述锚定部分[am]包含固醇、脂质、维生素、肽、或其组合以及可选地间隔子。
3.根据权利要求2所述的细胞外囊泡，其中所述可选的间隔子是烷基间隔子。
4.根据权利要求3所述的细胞外囊泡，其中所述烷基间隔子是c1、c2、c3、c4、c5、c6、c7、c8、c9、c10、c11、c12、c13、c14或c15。
5.根据权利要求3所述的细胞外囊泡，其中所述烷基间隔子是c6或c8。
6.根据权利要求2所述的细胞外囊泡，其中所述可选的间隔子是甘醇间隔子。
7.根据权利要求5所述的细胞外囊泡，其中所述甘醇间隔子具有2(二甘醇)、3(三甘醇)、4(四甘醇；teg)、5(五甘醇)、6(六甘醇；heg)、7、8、9、10、11、12、13、14或15个甘醇单元。
8.根据权利要求5所述的细胞外囊泡，其中所述甘醇间隔子是四甘醇(teg)。
9.根据权利要求2所述的细胞外囊泡，其中所述固醇选自由以下各项组成的组：胆固醇、麦角固醇、7-脱氢胆固醇、24s-羟基胆固醇、羊毛固醇、环阿屯醇、岩藻固醇、大褐马尾藻固醇、菜油固醇、β-谷固醇、谷甾烷醇、粪固醇、燕麦固醇和豆固醇。
10.根据权利要求2所述的细胞外囊泡，其中所述固醇是胆固醇。
11.根据权利要求2所述的细胞外囊泡，其中所述脂质是脂肪酸。
12.根据权利要求11所述的细胞外囊泡，其中所述脂肪酸是直链脂肪酸。
13.根据权利要求11所述的细胞外囊泡，其中所述脂肪酸是直链脂肪酸、支链脂肪酸、不饱和脂肪酸、单不饱和脂肪酸、多不饱和脂肪酸、羟基脂肪酸、多元羧酸、或其任何组合。
14.根据权利要求12所述的细胞外囊泡，其中所述直链脂肪酸是丁酸、己酸、辛酸、癸酸、月桂酸、肉豆蔻酸、棕榈酸或硬脂酸。
15.根据权利要求12所述的细胞外囊泡，其中所述直链脂肪酸是棕榈酸。
16.根据权利要求2所述的细胞外囊泡，其中所述维生素是维生素e(生育酚或生育三烯酚)、维生素d、维生素k、核黄素、烟酸或吡哆醇。
17.根据权利要求2所述的细胞外囊泡，其中所述维生素是维生素e(生育酚或生育三烯酚)。
18.根据权利要求1-17中任一项所述的细胞外囊泡，其中l1是包含磷酸二酯键的可裂解的键联或包含硫代磷酸酯键的不可裂解的键联。
19.根据权利要求1-18中任一项所述的细胞外囊泡，其中l2是可选的包含磷酸二酯键的可裂解的键联或包含硫代磷酸酯键的不可裂解的键联。
20.根据权利要求1-19中任一项所述的细胞外囊泡，其中l3是可选的包含磷酸二酯键的可裂解的键联或包含硫代磷酸酯键的不可裂解的键联。
21.根据权利要求1-20中任一项所述的细胞外囊泡，其中sp1可选的第一间隔子和/或sp2可选的第二间隔子独立地包括烷基间隔子、甘醇间隔子、或其组合。
22.根据权利要求21所述的细胞外囊泡，其中所述烷基间隔子是c1、c2、c3、c4、c5、c6、c7、c8、c9、c10、c11、c12、c13、c14或c15。
23.根据权利要求21所述的细胞外囊泡，其中所述烷基间隔子是c3或c6。
24.根据权利要求21所述的细胞外囊泡，其中所述甘醇间隔子具有2(二甘醇)、3(三甘醇)、4(四甘醇；teg)、5(五甘醇)、6(六甘醇；heg)、7、8、9、10、11、12、13、14或15个甘醇单元。
25.根据权利要求21所述的细胞外囊泡，其中所述甘醇间隔子是四甘醇(teg)或六甘醇(heg)。
26.根据权利要求1至25中任一项所述的细胞外囊泡，其中每个不可裂解的间隔子独立地选自烷基、二甘醇、三甘醇、四甘醇(teg)、六甘醇(heg)、五甘醇、聚乙二醇(peg)、甘油、二甘油、三甘油、四甘油(tg)、五甘油、六甘油(hg)、聚甘油(pg)、琥珀酰亚胺、马来酰亚胺、或其任何组合。
27.根据权利要求26所述的细胞外囊泡，其中所述聚乙二醇(peg)的特征在于式r1-(o-ch2-ch2)n-或r1-(o-ch2-ch2)n-o-，其中r1是氢、甲基或乙基，并且n是1至15之间的整数。
28.根据权利要求26所述的细胞外囊泡，其中所述聚甘油(pg)的特征在于式((r1—o—(ch2—choh—ch2o)n—)，其中r1是氢、甲基或乙基，并且n是1至15之间的整数。
29.根据权利要求1至28中任一项所述的细胞外囊泡，其中l1、l2或l3可裂解的键联或其任何组合包括氧化还原可裂解的接头、活性氧可裂解的接头、ph依赖性可裂解的接头、酶可裂解的接头、蛋白酶可裂解的接头、酯酶可裂解的接头、磷酸酶可裂解的接头、光活化的可裂解的接头、自分解性的接头、或其任何组合。
30.根据权利要求1至29中任一项所述的细胞外囊泡，其中l1、l2或l3可裂解的键联或其任何组合包括自分解性的接头。
31.根据权利要求1至30中任一项所述的细胞外囊泡，其中l1、l2或l3可裂解的键联或其任何组合包括肉桂基、萘基、联苯基、杂环、同源芳族、香豆素、呋喃、噻吩、噻唑、噁唑、异噁唑、吡咯、吡唑、吡啶、咪唑酮、三唑、或其任何组合。
32.根据权利要求1至31中任一项所述的细胞外囊泡，其中l1、l2或l3可裂解的键联或其任何组合具有式：
33.根据权利要求32所述的细胞外囊泡，其中-aa-是二肽、三肽、四肽、五肽或六肽、或其组合，其中组合中的每个二肽、三肽、四肽、五肽或六肽能够是相同的或不同的。
34.根据权利要求33所述的细胞外囊泡，其中a是2，并且–aa-是选自由以下各项组成的组：缬氨酸-丙氨酸、缬氨酸-瓜氨酸、苯丙氨酸-赖氨酸、n-甲基缬氨酸-瓜氨酸、环己基丙氨酸-赖氨酸、谷氨酸-缬氨酸-瓜氨酸、和β-丙氨酸-赖氨酸。
35.根据权利要求33所述的细胞外囊泡，其中所述–aa-是缬氨酸-丙氨酸、缬氨酸-瓜氨酸、或谷氨酸-缬氨酸-瓜氨酸。
36.根据权利要求31至35中任一项所述的细胞外囊泡，其中y是1。
37.根据权利要求31至36中任一项所述的细胞外囊泡，其中-y-是自分解性的间隔子。
38.根据权利要求37所述的细胞外囊泡，其中–yy-具有下式：
39.根据权利要求38所述的细胞外囊泡，其中m是0、1或2。
40.根据权利要求38所述的细胞外囊泡，其中m是0。
41.根据权利要求31至40中任一项所述的细胞外囊泡，其中l1、l2或l3可裂解的键联或其任何组合包括缬氨酸-丙氨酸-氨基甲酸对氨基苄酯、或缬氨酸-瓜氨酸-氨基甲酸对氨基苄酯。
42.根据权利要求31至36中任一项所述的细胞外囊泡，其中-y-是非自分解性的间隔子。
43.根据权利要求42所述的细胞外囊泡，其中所述非自分解性的间隔子是–gly-或–gly-gly-。
44.根据权利要求1至43中任一项所述的细胞外囊泡，其中所述锚定部分[am]包含支架蛋白。
45.根据权利要求44所述的细胞外囊泡，其中所述锚定部分[am]和/或支架部分是支架x。
46.根据权利要求45所述的细胞外囊泡，其中所述支架x选自由以下各项组成的组：前列腺素f2受体负调节因子(ptgfrn蛋白)；basigin(bsg蛋白)；免疫球蛋白超家族成员2(igsf2蛋白)；免疫球蛋白超家族成员3(igsf3蛋白)；免疫球蛋白超家族成员8(igsf8蛋白)；整联蛋白β-1(itgb1蛋白)；整联蛋白α-4(itga4蛋白)；4f2细胞表面抗原重链(slc3a2蛋白)；atp转运蛋白的类型(atp1a1、atp1a2、atp1a3、atp1a4、atp1b3、atp2b1、atp2b2、atp2b3和atp2b4蛋白)；其功能性片段；及其任何组合。
47.根据权利要求45所述的细胞外囊泡，其中所述支架x是ptgfrn蛋白或其功能性片段。
48.根据权利要求45所述的细胞外囊泡，其中所述支架x包含如seq id no:302中列出的氨基酸序列。
49.根据权利要求45所述的细胞外囊泡，其中所述支架x包含与seq id no:302至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或约100％同一的氨基酸序列。
50.根据权利要求1至49中任一项所述的细胞外囊泡，其中所述生物活性分子[bam]经由锚定部分[am]连接到ev的外表面。
51.根据权利要求1至50中任一项所述的细胞外囊泡，其中所述生物活性分子是多肽、肽、多核苷酸(dna和/或rna)、化学化合物、或其任何组合。
52.根据权利要求51所述的细胞外囊泡，其中所述生物活性分子是化学化合物。
53.根据权利要求52所述的细胞外囊泡，其中所述化学化合物是小分子。
54.根据权利要求1至53中任一项所述的细胞外囊泡，其中所述生物活性分子包含反义寡核苷酸(aso)、sirna、mirna、shrna、mrna、核酸、或其任何组合。
55.根据权利要求1至54中任一项所述的细胞外囊泡，其中所述生物活性分子包含肽、蛋白质、抗体或其抗原结合片段、或其任何组合。
56.根据权利要求55所述的细胞外囊泡，其中所述其抗原结合片段包含scfv、(scfv)2、fab、fab'、f(ab')2、f(ab1)2、fv、dab和fd片段、双功能抗体、抗体相关多肽、或其任何片段。
57.根据权利要求54所述的细胞外囊泡，其中所述生物活性分子包含aso。
58.根据权利要求57所述的细胞外囊泡，其中所述aso靶向转录物。
59.根据权利要求58所述的细胞外囊泡，其中所述转录物是stat6转录物、cebp/β转录物、stat3转录物、kras转录物、nras转录物、nlpr3转录物、或其任何组合。
60.根据权利要求1至59中任一项所述的细胞外囊泡，其中所述ev是外泌体。
61.根据权利要求60所述的细胞外囊泡，其中所述外泌体是天然外泌体。
62.根据权利要求60所述的细胞外囊泡，其中所述外泌体是过表达ptgfrn的外泌体或其功能性片段。
63.一种药物组合物，其包含根据权利要求1至62中任一项所述的细胞外囊泡和药学上可接受的载剂。
64.一种试剂盒，其包含根据权利要求1至62中任一项所述的ev或根据权利要求63所述的药物组合物和使用说明书。
65.一种在有需要的受试者中治疗或预防疾病或病症的方法，其包括向受试者施用根据权利要求1至62中任一项所述的ev或根据权利要求63所述的药物组合物。
66.根据权利要求65所述的方法，其中所述疾病或病症是癌症、炎症性病症、神经退行性疾病、中枢神经疾病或代谢性疾病。
67.根据权利要求65或66所述的方法，其中所述ev通过静脉内、腹膜内、鼻内、经口、肌内、皮下、胃肠外或肿瘤内施用。
68.一种将生物活性分子(bam)连接到ev的方法，其包括将锚定部分(am)连接到ev，其中根据下式所述锚定部分(am)连接到生物活性部分(bam)：
69.根据权利要求68所述的方法，其中[am]是胆固醇-c6、胆固醇-teg、生育酚-c8、生育酚、或棕榈酸酯-c6。
70.根据权利要求68或69所述的方法，其中l1、l2或l3或其组合是磷酸二酯键。
71.根据权利要求68至70中任一项所述的方法，其中sp1是c3、c6、teg或heg。
72.根据权利要求68至71中任一项所述的方法，其中l1、l2或l3或其组合是硫代磷酸酯键。
73.根据权利要求68至72中任一项所述的方法，其中sp2是c3、c6、teg或heg。
74.根据权利要求68至73中任一项所述的方法，其中l1、l2或l3或其组合是硫代磷酸酯键。
75.根据权利要求68至74中任一项所述的方法，其中[bam]是反义寡核苷酸(aso)。
76.一种增加连接到ev的生物活性分子(bam)的负载密度的方法，其包括筛选根据下式连接到生物活性部分(bam)的大量的锚定部分(am)：
77.根据权利要求76所述的方法，其中[am]是胆固醇-c6、胆固醇-teg、生育酚-c8、生育酚、或棕榈酸酯-c6。
78.根据权利要求76或77所述的方法，其中l1、l2或l3或其组合是磷酸二酯键。
79.根据权利要求76至78中任一项所述的方法，其中sp1是c3、c6、teg或heg。
80.根据权利要求76至79中任一项所述的方法，其中l1、l2或l3或其组合是硫代磷酸酯键。
81.根据权利要求76至80中任一项所述的方法，其中sp2是c3、c6、teg或heg。
82.根据权利要求76至81中任一项所述的方法，其中l1、l2或l3或其组合是硫代磷酸酯键。
83.根据权利要求76至82中任一项所述的方法，其中[bam]是反义寡核苷酸(aso)。
84.根据权利要求76至83中任一项所述的方法，其中连接到ev的生物活性分子(bam)的负载密度增加至少约1倍、至少约1.5倍、至少约2倍、至少约2.5倍、至少约3倍、至少约4倍、至少约5倍、至少约6倍、至少约7倍、至少8倍、至少约9倍、或至少约10倍。
85.一种细胞外囊泡(ev)，其包括根据下式经由锚定部分[am]与ev共价连接的反义寡核苷酸[aso]：
86.根据权利要求84所述的ev，其中所述ev是外泌体。
87.根据权利要求85所述的ev，其中所述外泌体是天然外泌体。
88.根据权利要求86所述的ev，其中连接到外泌体的aso的负载密度增加了至少约1.5倍。
89.根据权利要求86所述的ev，其中所述锚定部分[am]是胆固醇-c6。
90.根据权利要求88所述的ev，其中每个外泌体的aso分子的平均数量为5032+/-386。
91.根据权利要求88所述的ev，其中每个外泌体的aso分子的平均数量在约4500至约5500之间。
92.根据权利要求88所述的ev，其中每个外泌体的aso分子的...
【专利技术属性】
技术研发人员：A·诺伊斯，E·张，W·布鲁姆，C·沃伦，张耀中，E·罗斯，
申请(专利权)人：隆萨销售股份有限公司，
类型：发明
国别省市：
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