【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及神经生物，特别涉及一种携带optn基因表达框的重组腺相关病毒颗粒的制作方法及其用途。
技术介绍
1、基因转导技术的进步以及对疾病机制的深入研究为疾病的基因治疗开启了新的篇章。虽然人类的基因治疗仍然处在初始阶段，但一系列早期临床试验已经证实了这种治疗手段的安全性和有效性。
2、腺相关病毒(aav)是一种复制缺陷型细小病毒。腺相关病毒的宿主细胞范围广，主要体现在腺相关病毒可以感染广泛的哺乳动物细胞并且已成功应用于人源和非人源蛋白的表达，重组腺相关病毒能感染分裂期和非分裂期细胞。
3、腺相关病毒具有长期的基因表达能力，重组aav能保存于人类宿主细胞中，保持长期的基因转录表达能力，对于终末分化的细胞这个优点特别明显。这是因为绝大多数重组aav不会整合到基因组上，而是串联形成附加体(episome)存在于细胞核中。分裂的细胞在细胞复制和分裂后失去会丢失附加体，并因此失去基因表达能力。病毒能整合迚宿主基因组，导致基因在分裂期细胞内长期表达。
4、腺相关病毒具有低免疫原性，与已获得临床应用的腺病毒载体相比，aav在注射后引起的免疫反应是微弱并且短暂的。大剂量全身性特别是尾静脉使用虽然也会导致抗体的产生，但很少有感染上的细胞之后被细胞免疫系统所清除，这被认为与aav对抗体呈递细胞感染(apc)较弱相关。当aav用于局部感染肌肉、脑、眼等组织时，重复感染效率基本上不会受到太大的影响。这种特性对于动物实验上的使用显然极有帮助。
5、腺相关病毒具有良好扩散性，aav的病毒粒径只有腺病毒的1
6、肌萎缩侧索硬化(amyotrophic lateral sclerosis，als)是以上、下运动神经元缺失及神经胶质细胞增生为特征的进行性神经系统变性疾病。als病程持续进展，病人多因呼吸肌麻痹或并发呼吸道感染死亡，生存期平均27-52个月。尽管als的病因尚不明确，但是目前研究认为，als的发病机制主要与rna代谢紊乱、蛋白质稳态异常、线粒体功能障碍、氧化应激、兴奋性氨基酸毒性、dna损伤、胶质细胞病变及细胞内核质运输障碍等有关。最新的流行病学统计显示，als的患病率约为每年每十万分之五。我国大约有20万余病人。该病具有进展性和致死性的特点，尽管als已经对人类的健康产生了越来越大的威胁，并给家庭和社会带来了沉重的负担，但到目前为止仍然没有控制疾病的有效手段。fda批准的第一个口服药物利鲁唑(riluzole)，价格昂贵，且仅能延长患者生命约3-4个月；2017年fda最新批准的自由基清除药物依达拉奉(edaravone)，早期临床研究仍存在争议，且目前研究提示依达拉奉似乎不适用于所有类型的als患者。
7、通过基因转导技术来治疗疾病和延缓疾病进展已经是目前医学的一大重要课题，目前对于als的基因治疗研究主要基于反义寡核苷酸(asos)、腺病毒(aav)/慢病毒(lv)载体以及间充质干细胞慢病毒载体系统。而腺相关载体具有相对成熟的包装系统，便于规模化生产。目前国内外常用的aav载体包装系统主要包括三质粒共转染系统、腺病毒为辅助病毒系统、单纯疱疹病毒(herpes simplex virus type 1，hsv1)为辅助病毒的包装系统以及基于杆状病毒的包装系统。其中，质粒转染包装系统因无需辅助病毒，安全性高，是应用最为广泛的aav载体包装系统，也是目前国际上主流的生产系统。
8、因此如何利用基因转导技术更好的利用腺相关载体延缓肌萎缩侧索硬化疾病进展是我们需要攻克的技术难题。
技术实现思路
1、有鉴于此，本专利技术提供了一种携带optn基因表达框的重组腺相关病毒颗粒的制作方法，本专利技术还提供了一种携带optn基因表达框的重组腺相关病毒颗粒的用途，延缓肌萎缩侧索硬化的疾病进展。
2、第一方面，本专利技术提供了一种携带optn基因表达框的重组腺相关病毒颗粒的制作方法，采用腺相关病毒9型(aav9)为载体，从基因库中筛选optn核苷酸序列，构建optn质粒，将质粒与载体病毒整合为一起，形成了一种携带人为设计optn基因表达框的重组腺相关病毒aav9-optn。具体步骤如下：
3、步骤1：是把optn基因克隆进合适的病毒载体：大多数情况下，optn基因被克隆到一个包含itr/mcs的载体中。这些载体中反向末端重复(itr)序列提供所有aav复制和包装必须的顺式作用元件。
4、步骤2：重组表达质粒同phelper(携带腺病毒来源的基因)和paav-rc(携带aav复制和衣壳基因)共转染进aav-293细胞(提供aav复制和包装所需的反式作用因子)。转染2到3天后重组aav在包装细胞中组装完成。
5、步骤3：从被感染aav-293细胞中收集aav病毒颗粒，一般aav颗粒会富集在包装细胞中，所以收集细胞而后裂解释放aav颗粒到上清中可以回收大部分的aav颗粒。这一步得到的病毒上清液随后用于感染各种哺乳动物类细胞系的感染实验。同时上清中的病毒也可以浓缩保留。
6、步骤4：浓缩并纯化第三步的病毒上清液，原上清液里面包含了许多细胞蛋白分子和碎片，通过2次cscl密度梯度离心和1次超滤可以去除绝大部分的细胞蛋白和残留的cscl离子。动物实验都需要纯化后的病毒才能够进行，否则会达不到所需剂量并引起副作用。感染宿主细胞后，基因表达前，单链病毒必须变成双链病毒。这个转变是重组基因表达的限制步骤，可以通过腺病毒双重感染或依托泊苷(喜树碱或丁酸钠)来加速。然而，加速基因表达的试剂对目标细胞是有毒的，如果残留到细胞上会杀死目标细胞。因此依托泊苷只能短期使用或为了提高病毒滴度时使用。
7、第二方面，本专利技术还提供了上述携带optn基因表达框的重组腺相关病毒颗粒的用途。携带optn基因表达框的重组腺相关病毒通过快速、有效地能够在肌萎缩侧索硬化的成熟脊髓和脑组织内引起广泛转基因表达的载体腺相关病毒aav表达自噬载体蛋白optn，可对线粒体产生保护作用，激活自噬通路，从而保护神经元，延缓肌萎缩侧索硬化的疾病进展。
8、其中，所述的药物通过重组腺相关病毒载体携带optn基因片段，在体内诱导optn的持续表达，使机体自行合成正常的optn蛋白。
9、其中，所述optn蛋白是一种自噬受体，选择性地与标记为降解的货物结合，并将其递送到自噬体，从而将细胞内异常的蛋白、细胞器等物质降解。
10、通过鞘内注射法，鞘注aav9-optn，可使optn在神经元中高度表达，激活als转基因模型动物的自噬通路，并对线粒体产生保护作用，其中线粒体是代谢和分子信号传导的重要细胞器，线粒体损伤是神本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种携带OPTN基因表达框的重组腺相关病毒颗粒的制作方法，其特征在于，采用腺相关病毒9型(AAV9)为载体，从基因库中筛选OPTN核苷酸序列，构建OPTN质粒，将质粒与载体病毒整合为一起，形成了一种携带人为设计OPTN基因表达框的重组腺相关病毒AAV9-OPTN。具体步骤如下：
2.携带OPTN基因表达框的重组腺相关病毒颗粒在治疗肌萎缩侧索硬化药物中的用途。
3.如权利要求2所述的用途，其特征在于，所述的药物通过重组腺相关病毒载体携带OPTN基因片段，在体内诱导OPTN的持续表达，使机体自行合成正常的OPTN蛋白。
4.如权利要求3所述的用途，其特征在于，所述OPTN蛋白是一种自噬受体，选择性地与标记为降解的货物结合，并将其递送到自噬体，从而将细胞内异常的蛋白、细胞器等物质降解。
【技术特征摘要】
1.一种携带optn基因表达框的重组腺相关病毒颗粒的制作方法，其特征在于，采用腺相关病毒9型(aav9)为载体，从基因库中筛选optn核苷酸序列，构建optn质粒，将质粒与载体病毒整合为一起，形成了一种携带人为设计optn基因表达框的重组腺相关病毒aav9-optn。具体步骤如下：
2.携带optn基因表达框的重组腺相关病毒颗粒在治疗肌萎缩侧索硬化药...
【专利技术属性】
技术研发人员：温迪，刘亚坤，李媛媛，刘畅，李忠尧，
申请(专利权)人：河北医科大学第二医院，
类型：发明
国别省市：
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