【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生物医药，尤其是涉及一种番茄红素制剂及其制备方法。
技术介绍
1、番茄红素(lycopene,lyc)是植物中一种天然色素，属于不含氧的类胡萝卜素。番茄红素分子式为c40h56，分子量536.85da。分子结构中含有11个共轭双键和2个非共轭双键组成的直链型碳氢化合物。番茄红素是自然界中最强的抗氧化剂之一，抗氧化功能是胡萝卜素的3.2倍，维生素e的100倍。具有抗氧化、心脏保护、降血脂、抗肿瘤、光保护、抗菌和糖尿病等功效。番茄红素属于世界卫生组织认定的a类营养素，广泛应用于食品色素、保健食品、医药和化妆品工业等众多领域，甚至被称为“植物中的黄金”。
2、番茄红素在人体生理和病理过程中均发挥重要作用，广泛存在于人体内，如血液、肾上腺、肝脏、睾丸、前列腺、乳腺、卵巢、子宫、消化道等器官。但人体却无法制造番茄红素，只能从膳食中摄取。
3、番茄红素存在于瓜果蔬菜中，如番茄、胡萝卜、西瓜和番石榴等，其中以番茄中含量最高。番茄红素不溶于水，难溶于甲醇、乙醇等强极性有机溶剂；化学性质十分活泼、易受氧化、紫外线、温度、湿度等影响而迅速氧化分解，影响其生物利用度和营养功效。
4、目前有多种工艺和剂型以增加其溶解性和稳定性。纳米制剂是目前被认为最具前景的方法，包括纳米乳液(nanoemulsions，ne)、脂质体(liposome)、类脂囊泡(niosomes，ni)、纳米结构脂质载体(nanostructured lipid carriers,nlc)、固体脂质纳米微粒(solid lipid
5、外泌体(exosome，exo)是由活细胞生成的纳米级(30-150nm)脂性囊泡，不仅可用于加载蛋白、核酸、代谢物、小分子药物等，而且可通过修饰膜表面的蛋白或脂类，赋予其靶向性、免疫封闭、逃逸网状内皮吞噬、细胞摄取等特征。继病毒和脂质体之后，外泌体被称为“第三代载体”，具有低免疫原性、高生物利用度、高载药效率、可透过生物屏障(包括肠粘膜屏障)等优势。外泌体成为最具潜力的药物载体之一。
6、目前市场上番茄红素剂型绝大部分为胶囊制剂，稳定性制剂主要包括以各类糊精、蛋白和淀粉为辅料制备的包合物类制剂和微胶囊类制剂、以小分子脂质、磷脂等为载体制备的微乳类制剂和脂质体类制剂等。虽然通过胶囊物理保护可防止其被氧化，但在体内仍然受胃肠道化学(胃酸)和生物(肠道酶类)的降解，生物利用度较低。新的微囊包裹技术包括上述的纳米乳液、脂质体、类脂囊泡、纳米结构脂质载体、固体脂质纳米微粒的新技术均属于化学合成方法，存在潜在毒性问题。也面临成本高和操作复杂等难题。
7、外泌体属于纯天然的载体，具有免疫原性低、生物相容性好、稳定性高等优点。但目前大多数采用干细胞分泌外泌体，存在制备复杂和成本高的问题。外泌体分离纯化最多采用超速离心方法，由于口服营养素需要较大剂量的外泌体，因此超速离心方法不能满足需要。
8、因此，开发一种新的载体，从而制备得到更稳定的番茄红素制剂是非常必要的。
技术实现思路
1、有鉴于此，本专利技术要解决的技术问题在于提供一种番茄红素制剂的制备方法，本专利技术制备的番茄红素制剂稳定性好。
2、本专利技术提供了一种番茄红素制剂的制备方法，包括：
3、a)番茄红素溶液和牛奶外泌体混合，孵育、离心，得到上清液；
4、b)上清液超速离心，取沉淀重悬，再次离心，得到包裹番茄红素的外泌体。
5、本专利技术提供的番茄红素制剂的制备方法首先制备牛奶外泌体。
6、本专利技术所述牛奶外泌体的制备方法具体为：
7、a)牛奶预处理后经切向流膜过滤，得到切向流膜过滤浓缩后样本；
8、b)将切向流膜过滤浓缩后样本采用层析柱分离纯化后，得到牛奶外泌体。
9、本专利技术对于牛奶不进行限定，本领域技术人员熟知的即可。本专利技术中作为番茄红素载体的外泌体来自于牛奶，可以是未经处理的生牛奶，也可以是巴氏消毒处理的牛奶。优选为新鲜生牛奶。上述用于提取外泌体的奶原料，除牛奶外还可以为牛初乳、牦牛奶、羊奶、骆驼奶甚至人奶等。
10、所谓“牛奶外泌体”准确描述应为“牛奶来源的外泌体样纳米囊泡(milk-derivedexosome-like nano-vesicles)”。其大小为30～1000nm，根据不同的分离和纯化方法可有不同的粒径范围，例如80-200nm或100～150nm。外泌体大小采用纳米粒径跟踪分析(nanoparticle tracking analysis,nta)或动态光散射(dynamic light scattering,dls)等方法测量。
11、牛奶首先经过预处理。所述预处理具体为：离心、除去上层脂类和细胞碎片等颗粒物沉淀，得到上清液；上清液调节ph值孵育，再次离心，上清液经膜过滤。
12、首先牛奶保存于4℃，1500g，离心30min，倾倒或采用滤纸过滤去除上层脂类。弃除沉淀，上清液转移至新离心管中；重复上述步骤，完全除去牛奶中的脂肪和细胞、细胞碎片。脱脂处理后牛奶上清，加入10％柠檬酸溶液至ph值达到4.6，室温下孵育10min；10000g离心15min，弃沉淀，上清液膜过滤。所述膜为混合纤维素(mce)微孔滤膜；所述膜孔径为0.22～1μm。经1.0μm、0.45μm和0.22μm。上述滤膜可以去除较大蛋白聚合体和细胞碎片等颗粒物。
13、本专利技术上述牛奶预处理包括但不限于酸化、酶和螯合剂等。酸化处理可采用乙酸、盐酸、柠檬酸等，优选用柠檬酸；酶处理法包括乳凝酶，如木瓜乳凝酶，胃蛋白酶、脂肪酶等；优选采用木瓜乳凝酶；ca2+螯合剂包括乙二胺四乙酸(edta)、乙二醇双四乙酸(egta)等。可用其中一种或二种以上组合处理。
14、预处理后的牛奶经切向流膜过滤，得到切向流膜过滤浓缩后样本。
15、先排空系统的保存液，用去离子水冲洗后，经平衡缓冲液冲洗中空纤维柱后，上样预处理的牛奶样本。所述中空纤维柱的规格是750kda；
16、在本专利技术其中一部分优选实施方式中：用平衡缓冲液进行连续补液置换(设置置换体积500ml，低于500ml进行补液)所述过滤流速为10ml/min。直至透过蛋白洗至0.00mg/ml。待透过的蛋白为0.00mg/ml后，将杯中的500ml溶液继续浓缩至原有体积的1/20。
17、本专利技术所述切向流膜过滤参数具体为：
18、tmp最大压力2bar、报警压力2bar、最小体积200ml、报警体积200ml；
19、将切向流膜过滤浓缩后样本采用分子排本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种番茄红素制剂的制备方法，其特征在于，包括：
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述牛奶外泌体的制备方法具体为：
3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤a)所述切向流膜过滤参数具体为：
4.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤b)所述层析柱分离纯化具体为：层析柱平衡、上柱、洗脱后收集各组分，所述洗脱剂为无菌PBS缓冲液；所述洗脱流速为15ml/min；采用BCA蛋白定量和Western Blot相结合，确定含有mEV的组分；
5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤a)所述预处理具体为：
6.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述番茄红素溶液为番茄红素溶于乙醇中；所述番茄红素溶液中番茄红素的浓度为6～10mg/mL；
7.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤A)所述番茄红素溶液和牛奶外泌体的体积比为1:1。
8.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤A)所述孵育为20～30℃孵育10～15min；所述离心为10000g离心
9.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤B)所述超速离心为135000g超速离心90min；所述重悬为用PBS缓冲液重悬；所述再次离心为10000g离心10min；所述离心后还包括用0.22μm膜过滤。
10.一种番茄红素制剂，其特征在于，由权利要求1～9任意一项所述的制备方法制备得到。
...【技术特征摘要】
1.一种番茄红素制剂的制备方法，其特征在于，包括：
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述牛奶外泌体的制备方法具体为：
3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤a)所述切向流膜过滤参数具体为：
4.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤b)所述层析柱分离纯化具体为：层析柱平衡、上柱、洗脱后收集各组分，所述洗脱剂为无菌pbs缓冲液；所述洗脱流速为15ml/min；采用bca蛋白定量和western blot相结合，确定含有mev的组分；
5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤a)所述预处理具体为：
6.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述番茄红素溶液...
【专利技术属性】
技术研发人员：白玉杰，张文红，
申请(专利权)人：逸惟生物科技北京有限公司，
类型：发明
国别省市：
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