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【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物,具体涉及一种改善线粒体功能障碍的的工程化植物外泌体的制备方法及应用。
技术介绍
1、神经退行性疾病是神经元结构或功能的渐进和选择性丧失(包括神经元死亡),而导致功能障碍的一类疾病,包括帕金森病(parkinson’s disease,pd)、阿尔茨海默病(alzheimer’s disease,ad)、亨廷顿氏病(huntington disease,hd)、肌萎缩侧索硬化症(amyotrophic lateral sclerosis,als)以及脊髓性肌萎缩症(spinal muscularatrophy,sma)等等。ad及pd主要发生于中老年人,随着人口老龄化,ad及pd的发病日益增多,而hd、als及sma等在各个年龄都可能发生。目前,这类疾病的病因尚不明确且无法治愈,严重威胁着人类健康的同时也造成了巨大的经济负担。
2、线粒体在真核生物的能量产生和代谢中起重要作用,也通过参与脂代谢、铁代谢、氨基酸合成、血红素合成、钙离子平衡、天然免疫响应等多种途径影响细胞的稳态,是导致神经退行性疾病神经元死亡的主要原因。神经元严重依赖于线粒体,由于其复杂的形态和高能量代谢要求,容易受到线粒体功能障碍的影响。因此,线粒体是神经退行性疾病的一个重要药物靶点,也是神经退行性疾病药物研发的热点。线粒体功能障碍可以导致损伤相关分子模式的释放,例如促炎因子。线粒体自噬是细胞进化过程中产生的一种通过自噬选择性清除受损线粒体的机制,及时清除损伤的线粒体对维持细胞正常生理功能具有重要作用。线粒体氧化磷酸化(oxphos)
3、此外,目前临床上针对于中枢神经退行性疾病的治疗仍缺乏有效的药物,且少数临床可用药物疗效低、不良反应大。同时,由于血脑屏障(bbb)的特殊结构和屏障作用,大多数传统药物依靠于化学合成的纳米载体(例如脂质体,胶束,聚合物纳米粒,无机纳米粒等),进而增强bbb穿透能力,提高生物利用度并减少毒副作用。然而,这些纳米载体普遍存在制备流程复杂,生物相容性低,容易诱发免疫应答等问题,限制了其深入应用。因此,迫切需要一种高效低毒的纳米载体用于增强药物的疗效。尽管动物来源的外泌体,如间充质干细胞、星形胶质细胞和自然杀伤细胞衍生的外泌体已被证明具有实现大脑富集的能力。然而,这些系统的瓶颈包括明显的免疫原性、加载外源性候选药物的效率低下、外泌体中其他成分(如动物病毒和细菌脂多糖)的生物风险。
4、相比之下,药用植物外泌体由于含有多种活性物质,具有免疫原性低、副作用小、治疗效果强的独特优势。近年来,作为天然的纳米制剂,药用植物来源的的外泌体富含各种具有生物活性的脂质、蛋白质、rna等成分,被证明在肿瘤、免疫调节、肠道疾病与再生医学等方面具有显著的调控作用。并且,植物来源的的外泌体兼具纳米载体的形态与特点,因此可作为低毒的纳米载体实现对疾病的干预。已有研究证明人参来源的外泌体可以通过递送功能性mirnas刺激干细胞的神经分化,成熟与功能化来促进周围神经修复和恢复神经传导速度进而加速伤口修复。目前,已经有许多药用植物被证明对中枢神经退行性疾病有治疗作用,包括五味子、柏子仁、绞股蓝、酸枣仁、茉莉根、蛇葡萄、苦豆子、全叶马兰、黑水缬草、肉苁蓉、细辛、川穹、三七、合欢属、冬凌草、石菖蒲、葛根、天麻、人参、黄芪、钩藤等,它们大都具有抗炎、抗氧化、抗凋亡和血脑屏障保护等多种神经保护作用,挖掘并明确其具体作用机制将有助于进一步将其应用于神经疾病治疗。
5、然而,未经修饰的天然植物外泌体在用于中枢神经退行性疾病治疗时缺乏向病灶炎症部位趋向性移动,血脑屏障穿透以及中枢神经元靶向的能力,且经系统或局部给药后易被清除,生物利用度较低,极大的限制了植物外泌体的治疗效果与应用前景。此外,即使植物外泌体成功到达靶组织,它们仍然必须与微环境中预先存在的外泌体竞争靶细胞。
6、目前,多种功能化策略被应用于外泌体的细胞特异性靶向。对动物细胞来源的外泌体而言,可以通过遗传工程对亲代细胞进行操作或通过调控细胞代谢过程在外泌体表面缀合细胞特异性靶向配体,然而这种方法操作成本昂贵,技术要求高,且工程化外泌体产量低。并且,这种功能化修饰手段对植物外泌体适用性低。
技术实现思路
1、针对用于中枢神经退行性疾病治疗的药物或递送体系不良反应大、递送效率低等问题,本专利技术旨在提供一种改善线粒体功能障碍的工程化植物外泌体的制备方法及应用。
2、植物外泌体的修饰策略集中依赖于共孵育的手段进行直接工程化。此外,借助动物细胞膜表面特定的受体,与动物细胞膜融合可以赋予天然植物外泌体良好的炎症部位趋向移动的能力,极大的提高其生物利用度。本专利技术将为植物外泌体高效应用于中枢神经退行性疾病治疗提供新型的借鉴意义与价值。
3、本专利技术通过对植物外泌体表面进行功能修饰提高其病灶部位富集水平、血脑屏障穿透能力以及神经元特异靶向性,以高效、低毒的方式将治疗性生物大分子递送至大脑损伤部位,通过改善线粒体功能障碍有效提高神经元的存活并恢复功能,为中枢神经退行性疾病的治疗提供了新的策略,并为药用植物来源的外泌体在中枢神经系统疾病治疗中的应用奠定了系统和科学的基础。
4、本专利技术旨在解决技术问题时采用的技术方案为:
5、本专利技术提出了一种改善线粒体功能障碍的工程化植物外泌体的制备方法,其特征在于,包括如下步骤:
6、1)将药用植物活性部位与磷酸盐缓冲液混合进行榨汁,得到浆体,浆体中药用植物活性部位的含量为0.1-2g/ml,优选为0.14-1g/ml,更优选为0.2-1;榨汁时间为3-20min,优选为3-10min,更优选为5-10min;
7、所述药用植物优选为五味子、柏子仁、绞股蓝、酸枣仁、茉莉根、蛇葡萄、苦豆子、全叶马兰、黑水缬草、肉苁蓉、细辛、川穹、三七、合欢属、冬凌草、石菖蒲、葛根、天麻、人参、黄芪、钩藤中的一种或多种;
8、2)使用筛网滤除浆体中的残渣并收集汁液,汁液通过差速离心法得到含植物外泌体的沉淀物;
9、所述的差速离心法优选为:将过滤所得汁液在4℃依次1000×g离心5-30min,4000×g离心30-60min,10000×g离心60-120min,得到上清液;再将上清液在4℃100000×g-150000×g离心60-120min,得到含植物外泌体的沉淀物;
10、3)将沉淀物用pbs重悬,pbs体积为2-20ml,优选为2-10ml,更优选为2-5ml,经0.22μm水系膜过滤器过滤得到植物外泌体;
11、4)将细胞膜和步骤3)得到的植物本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种改善线粒体功能障碍的工程化植物外泌体的制备方法,其特征在于,包括如下步骤:
2.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,所述步骤1)中的药用植物为五味子、柏子仁、绞股蓝、酸枣仁、茉莉根、蛇葡萄、苦豆子、全叶马兰、黑水缬草、肉苁蓉、细辛、川穹、三七、合欢属、冬凌草、石菖蒲、葛根、天麻、人参、黄芪、钩藤中的一种或多种。
3.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,所述的步骤2)中,所述的差速离心法为:将过滤所得汁液在4℃依次1000×g离心5-30min,4000×g离心30-60min,10000×g离心60-120min,得到上清液;再将上清液在4℃100000×g-150000×g离心60-120min,得到含植物外泌体的沉淀物。
4.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,所述的步骤4)的具体操作如下:
5.根据权利要求1或4所述的方法,其特征在于,所述的步骤4)中,所述的细胞膜为T细胞膜、NK细胞膜、巨噬细胞膜、中性粒细胞膜、神经干细胞膜、骨髓间充质干细胞膜中的一种或多种。
6.根据权利要求1所述的方法,其特征在
7.如权利要求1或6所述的方法,其特征在于所述的磷脂-聚乙二醇-靶向配体中的磷脂为二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺、二棕榈酰磷脂酰乙醇胺、二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱、二油酰磷脂酰乙醇胺、(2,3-二油酰基-丙基)-三甲胺、二油酰磷脂酰胆碱、二棕榈酰磷脂酰胆碱、二肉豆蔻酰基磷脂酰乙醇胺中的一种或多种。
8.如权利要求1或6所述的方法,其特征在于所述的磷脂-聚乙二醇-靶向配体中的聚乙二醇为PEG200、PEG300、PEG400、PEG600、PEG800、PEG1000、PEG1500、PEG2000、PEG3000、PEG4000、PEG6000、PEG8000中的一种或多种。
9.如权利要求1或6所述的方法,其特征在于所述的磷脂-聚乙二醇-靶向配体中的靶向配体为转铁蛋白、低密度脂蛋白、胰岛素、瘦素、RVG29、c(RGDyk)、c(RGDfk)、Angiopep-2、THR、CRT、g7、TGN、TAT、SynB1、RDP、KC2S、LCDX、DCDX、MiniAp-4、G23中的一种或多种。
10.一种工程化植物外泌体在制备治疗中枢神经退行性疾病药物中的应用,其特征在于,所述的工程化植物外泌体根据权利要求1-5任一项所述的方法制备得到;
...【技术特征摘要】
1.一种改善线粒体功能障碍的工程化植物外泌体的制备方法,其特征在于,包括如下步骤:
2.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,所述步骤1)中的药用植物为五味子、柏子仁、绞股蓝、酸枣仁、茉莉根、蛇葡萄、苦豆子、全叶马兰、黑水缬草、肉苁蓉、细辛、川穹、三七、合欢属、冬凌草、石菖蒲、葛根、天麻、人参、黄芪、钩藤中的一种或多种。
3.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,所述的步骤2)中,所述的差速离心法为:将过滤所得汁液在4℃依次1000×g离心5-30min,4000×g离心30-60min,10000×g离心60-120min,得到上清液;再将上清液在4℃100000×g-150000×g离心60-120min,得到含植物外泌体的沉淀物。
4.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,所述的步骤4)的具体操作如下:
5.根据权利要求1或4所述的方法,其特征在于,所述的步骤4)中,所述的细胞膜为t细胞膜、nk细胞膜、巨噬细胞膜、中性粒细胞膜、神经干细胞膜、骨髓间充质干细胞膜中的一种或多种。
6.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,所述的步骤5)的具体操作如下:
7.如权利要求1或...
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