本发明专利技术属于分子生物学领域，具体涉及一种用于种属和人类性别鉴定的组合物及含其试剂盒与应用。本发明专利技术提供了一种用于种属和人类性别鉴定的组合物，所述组合物包括第一核酸组合物、第二核酸组合物、第三核酸组合物和荧光探针组；所述第一核酸组合物和荧光探针组，与第二核酸组合物、第三核酸组合物中其中一种联合使用；其中第一核酸组合物的核苷酸序列如SEQ ID NO:1‑6所示；第二核酸组合物的核苷酸序列如SEQ ID NO:8‑13；第三核酸组合物的核苷酸序列如SEQ ID NO:15‑20所示。所述组合物灵敏度高，检测效率高，特异度高，可用于种属和人类性别的鉴定。
1、cytb基因是编码线粒体内膜上细胞色素b氧化酶的基因的一个亚基，由mtdna的h链所编码，其核苷酸序列总长约为1140bp，编码379个氨基酸。该基因的编码序列区域进化缓慢，相对保守，但是保守区中的可变区域进化快，不同种属间差异大，故可根据其序列差异来进行种属的区分。多数相关研究已经证明了cytb基因在种属鉴定中的有效性。y染色体特异性遗传标记在人类性别鉴定以及生物样本的起源方面有着非常重要的作用，这些标记还可以在性侵犯案件中提供重要信息，以确定受害者物品中是否存在男性dna。amelogenin基因是编码牙釉质蛋白的一段基因序列，amelx和amely为amelogenin基因座上的一对等位基因，分别位于xp22.1-22.3和yp11.2，二者之间具有88.9％的同源性。目前，已有部分研究者针对amelogenin基因的不同片段开发了不同引物组，将其用于性别鉴定，并应用于许多商业法医dna分型试剂盒中。
2、目前，法医学鉴定人员较为常用的种属鉴定方法有环状免疫沉淀法、抗人血红蛋白胶体金试验及各种dna分析技术；而性别鉴定更依赖于dna分析。常见的dna分析技术主要包括聚合酶链式反应(pcr)、多重pcr、实时荧光定量pcr技术、数字pcr技术、snp技术、测序技术等。但这些方法普遍存在一定不足，例如，耗时长、操作繁琐，并且依赖于精密复杂的仪器等，使检案过程过于繁琐耗时，不利于及时有效地打击犯罪。
>3、lamp技术是一种恒温扩增手段，相对于pcr技术，可在短时间内产生大量扩增子，对靶基因的识别具有更高的特异性与灵敏度。另外，多重lamp体系的应用也已出现，例如利用酶切法和焦磷酸测序法，但该方法基于终点检测，无法实现多各靶标分子的定量及实时检测。同时由于lamp体系所用dna聚合酶缺失5’-3’核酸外切酶活性，无法水解探针而释放荧光，使建立多重lamp扩增体系出现了一定技术瓶颈。现有研究报道所建立的基于荧光探针的多重lamp体系，主要是通过链置换激活，特异性仍然不足，并且该技术并不能对序列高度相似的snp进行区分，例如，中国专利申请201180040896.0公开了一种能够快速区分所选择病原体的所选择株与相同种内其它种群的基于基因的诊断法，可以通过使用寡核苷酸探针，称为“同化探针”，来完成dna的lamp的序列特异性实时监测，所述同化探针包含两条寡核苷酸链，其中一条包含猝灭剂(称为淬灭探针)而另一条包含荧光团(称为荧光探针)，在lamp反应期间，当所述两条链互相替换时，产生荧光信号；中国专利申请202110824236.7公开了一种基于lamp技术检测新型冠状病毒的引物探针组合、试剂盒及检测方法，所述引物探针组合包括n基因引物探针组合和/或e基因引物探针组合，所述探针包含两条寡核苷酸链，其中第一寡核苷酸链包含位于3’端的淬灭剂，第二寡核苷酸链包含位于5’端的荧光基团并在其5’部分与第一寡核苷酸链互补，在环介导等温扩增反应期间，当所述两条寡核苷酸链互相替换时，产生荧光信号。4、因此需要建立一种可用于法医学种属及性别鉴定、特异性更高的，可以对序列高度相似的snp进行区分的引物探针组。
技术实现思路
1、为了克服现有技术的缺陷，本专利技术提供了一种包含基于dna糖基酶激活的探针的组合物及含其试剂盒。该探针中引入含修饰碱基的脱氧核糖核苷酸，能被dna糖基酶进行特异性识别并激活荧光，相比于现有的仅基于链置换反应的荧光探针，进一步提高了反应的特异性。在此基础上，由于荧光产生不受引物二聚体形成的影响，可通过增加引物浓度来提高灵敏度。
2、本专利技术选用的种属特异性基因cytb位于呈环状、具有高拷贝数的线粒体dna上，比核dna更抗降解，可用于检测的目的dna丰度会更高，从而更适用于降解和痕量检材；不经过dna的分离提取过程，省去核酸纯化；采用基于udg酶的防污染系统，有效地避免了气溶胶对检测结果的干扰。通过本专利技术引物和探针的设计，可以实现单体系多重lamp对多种靶标的检测，建立了一种特异灵敏，快速有效的法医学生物检材种属及性别鉴定的快速检测方法。
3、为了实现上述的技术目的，本专利技术提出的技术方案如下所示：
4、在第一方面，本专利技术提供了一种用于种属和人类性别鉴定的组合物，所述组合物包括第一核酸组合物、第二核酸组合物、第三核酸组合物和荧光探针组；所述第一核酸组合物和荧光探针组，与第二核酸组合物、第三核酸组合物中其的一种联合使用；
5、其中，第一核酸组合物包括：
6、cytb-f3、cytb-b3、cytb-fip、cytb-bip、cytb-lf和cytb-lb；
7、第二核酸组合物包括：
8、amely-f3-1、amely-b3-1、amely-fip-1、amely-bip-1、amely-lf-1和amely-lb-1；
9、第三核酸组合物包括：
10、amely-f3-2、amely-b3-2、amely-fip-2、amely-bip-2、amely-lf-2和amely-lb-2；
11、所述cytb-f3的核苷酸序列如seq id no:1所示；
12、所述cytb-b3的核苷酸序列如seq id no:2所示；
13、所述cytb-fip的核苷酸序列如seq id no:3所示；
14、所述cytb-bip的核苷酸序列如seq id no:4所示；
15、所述cytb-lf-1的核苷酸序列如seq id no:5所示；
16、所述cytb-lb-1的核苷酸序列如seq id no:6所示；
17、所述amely-f3-1的核苷酸序列如seq id no:8所示；
18、所述amely-b3-1的核苷酸序列如seq id no:9所示；
19、所述amely-fip-1的核苷酸序列如seq id no:10所示；
20、所述amely-bip-1的核苷酸序列如seq id no:11所示；
21、所述amely-lf-1的核苷酸序列如seq id no:12所示；
22、所述amely-lb-1的核苷酸序列如seq id no:13所示；
23、所述amely-f3-2的核苷酸序列如seq id no:15所示；
24、所述amely-b3-2的核苷酸序列如seq id no:16所示；
25、所述amely-fip-2的核苷酸序列如seq id no:17所示；
26、所述amely-bip-2的核苷酸序列如seq id no:18所示；
27、所述amely-lf-2的核苷酸序列如seq id no:19所示；
28、所述amely-lb-2的核苷酸序列如s本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种用于种属和人类性别鉴定的组合物，其特征在于，所述组合物包括第一核酸组合物、第二核酸组合物、第三核酸组合物和荧光探针组；所述第一核酸组合物和荧光探针组，与第二核酸组合物、第三核酸组合物中的一种联合使用；
2.根据权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述第一核酸组合物、第二核酸组合物和第三核酸组合物的GC含量在40％-70％；和/或
3.根据权利要求1或2所述的组合物，其特征在于，所述荧光探针组至少包括三条荧光探针：
4.根据权利要求3所述的组合物，其特征在于，所述荧光探针中包含：一个碱基被替换为修饰碱基的脱氧核糖核苷酸；
5.根据权利要求4所述的组合物，其特征在于，所述荧光报告基团选自FAM，SIMA，HEX，ROX，TAMRA，Texas Red和CalFluor610中的至少一种；和/或
6.根据权利要求5所述的组合物，其特征在于，所述荧光探针的3’端修饰有阻断基团，所述阻断基团选自C3 Spacer，C6 Spacer，磷酸基团，氨基基团，生物素-TEG，聚六乙二醇、反转dT、反转dG或双脱氧核苷酸中的至少一种。
7.根据权利要求6所述的组合物，其特征在于，所述第一荧光探针的核苷酸序列如SEQID NO:7所示，所述第二荧光探针的核苷酸序列如SEQ ID NO:14所示，所述第三荧光探针的核苷酸序列如SEQ ID NO:21所示。
8.一种用于种属和人类性别鉴定的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求1-7中任一所述的组合物。
9.根据权利要求1-7中任一所述的组合物或权利要求8所述的试剂盒在鉴定种属和人类性别中的应用。
10.一种鉴定种属和人类性别的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
...
【技术特征摘要】
1.一种用于种属和人类性别鉴定的组合物，其特征在于，所述组合物包括第一核酸组合物、第二核酸组合物、第三核酸组合物和荧光探针组；所述第一核酸组合物和荧光探针组，与第二核酸组合物、第三核酸组合物中的一种联合使用；
2.根据权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述第一核酸组合物、第二核酸组合物和第三核酸组合物的gc含量在40％-70％；和/或
3.根据权利要求1或2所述的组合物，其特征在于，所述荧光探针组至少包括三条荧光探针：
4.根据权利要求3所述的组合物，其特征在于，所述荧光探针中包含：一个碱基被替换为修饰碱基的脱氧核糖核苷酸；
5.根据权利要求4所述的组合物，其特征在于，所述荧光报告基团选自fam，sima，hex，rox，tamra，texas red和calfluor610中的至少一种；和/或
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【专利技术属性】
技术研发人员：周浒云，胡文静，刘枭男，严江伟，
申请(专利权)人：山西医科大学，
类型：发明
国别省市：
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