【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及病毒生产工艺，尤其是涉及一种提高ped病毒表达的方法。
技术介绍
1、猪流行性腹泻(porcine epidemic diarrhea，ped)是由猪流行性腹泻病毒(porcine epidemic diarrhea virus，pedv)引起的一种以仔猪腹泻、呕吐和脱水为主要临床症状，最终破坏电解质平衡导致病猪死亡的一种急性腹泻病。目前，ped的波及范围较广，在全球均有病例报道，同时ped发病率高，幼年猪感染率高达100％，7日龄以下仔猪感染死亡率80％-100％，ped的频发已给养猪业造成严重的经济损失。
2、目前，许多研究在临床分离到了ped病毒，并在体外进行了细胞感染试验，试图通过体外培养来使该病毒增殖以期用于ped病毒疫苗的研制。而st细胞为猪睾丸细胞(swinetestis)，该细胞现已广泛应用于猪瘟病毒(sfv)、伪狂犬病毒(prv)和猪细小病毒(sfv)等的分离、体外增殖以及多种兽用疫苗的生产。
3、在病毒接毒工艺方面，传统的ped病毒性疫苗生产工艺是指st细胞生长到一定密度后，换液再接ped病毒或者直接接ped病毒。但原代病毒培养过程较为缓慢，病毒滴度不够高，对于疫苗的研发是一个需要解决的问题。现有技术中，使用cd st培养基培养st细胞并接种ped病毒进行ped病毒表达，在提升ped病毒表达主要通过调整细胞培养的参数，优化培养控制参数，例如转速、ph及病毒表达阶段的温度来达到提升ped病毒滴度的效果，这类方式对于提升ped病毒滴度的作用有限。
4、有鉴于此，特
技术实现思路
1、本专利技术的目的之一在于提供一种提高ped病毒表达的方法。所述方法通过在病毒表达阶段调整并维持细胞培养液的渗透压提高病毒产率的效果，并最终筛选出合适的渗透压控制范围值。
2、本专利技术的目的之二在于提供一种ped病毒表达产物。通过使用本技术方案中的方法，添加氯化钠试剂调整病毒表达阶段的细胞培养液的渗透压值控制并维持在360±10mosm/kg可以在原有的ped病毒表达的工艺基础上将病毒表达的病毒滴度从7.50log(tcid50/ml)提高8.50log(tcid50/ml)，提高了收获时ped抗原或种毒的病毒滴度。
3、为了实现本专利技术的上述目的，特采用以下技术方案：
4、第一方面，本专利技术提供一种提高ped病毒表达的方法，所述方法包括以下步骤：
5、将ped病毒接种于含st细胞的培养基中，通过调节培养基的渗透压值进行培养，实现对ped病毒表达的提高。
6、在动物细胞培养过程中，大多数的培养基的渗透压值在280～320mosm/kg之间，培养过程中添加的补料培养基和其他试剂对于渗透压都会有一定的影响；本专利技术使用的细胞株是st细胞株，通过在病毒表达阶段调整并维持细胞培养液的渗透压提高病毒产率的效果，并最终筛选出合适的渗透压控制范围值，通过调节培养基的渗透压值进行培养，实现对ped病毒表达的提高，能够显著提高病毒表达的病毒滴度。
7、优选地，所述渗透压值的调节范围为320～410mosm/kg，例如可以是320mosm/kg、330mosm/kg、340mosm/kg、350mosm/kg、360mosm/kg、370mosm/kg、380mosm/kg、390mosm/kg、400mosm/kg、410mosm/kg等，优选为350～370mosm/kg。
8、本专利技术添加氯化钠试剂调整病毒表达阶段的细胞培养液的渗透压值，当渗透压控制并维持在360±10mosm/kg时可以在原有的ped病毒表达的工艺基础上将病毒表达的病毒滴度从7.50log(tcid50/ml)提高至8.50log(tcid50/ml)以上，大大提高了收获时ped抗原或种毒的病毒滴度。
9、优选地，所述调节培养基的渗透压值的方式为向培养基中添加氯化钠。
10、优选地，所述培养基中氯化钠的浓度为0～10.0g/l，例如可以是0.001g/l、0.01g/l、0.1g/l、0.3g/l、0.5g/l、0.7g/l、1.0g/l、2.0g/l、5.0g/l、10.0g/l等，优选为0.3～1.0g/l。
11、在本专利技术中，添加氯化钠质量和体积之间也有较好的线性关系，公式如下式i所示：
12、m＝1.1302×v+0.4535 式i
13、其中，m代表氯化钠的质量，v代表氯化钠的体积。
14、优选地，所述含st细胞的培养基由以下步骤制备得到：
15、将st细胞接种于培养基中，进行细胞培养；再采用新鲜培养基对培养得到的st细胞进行稀释，调整培养基中的活细胞密度。
16、优选地，所述培养基为无血清cd st培养基，优选为cd st 258培养基。
17、优选地，所述st细胞的接种密度为0.3×106～4.0×106cells/ml，例如可以是0.3×106cells/ml、0.4×106cells/ml、0.5×106cells/ml、0.6×106cells/ml、0.7×106cells/ml、0.8×106cells/ml、0.9×106cells/ml、1.0×106cells/ml、2.0×106cells/ml、3.0×106cells/ml、4.0×106cells/ml等，优选为1.0×106cells/ml。
18、优选地，所述细胞培养的时间为60～84h，例如可以是60h、62h、64h、66h、68h、70h、72h、74h、76h、78h、80h、82h、84h等，优选为72h。
19、优选地，所述稀释后培养基中st活细胞密度为1.0×106～6.0×106cells/ml，例如可以是1.0×106cells/ml、2.0×106cells/ml、3.0×106cells/ml、4.0×106cells/ml、5.0×106cells/ml、6.0×106cells/ml等，优选为3.0×106cells/ml。
20、优选地，所述ped病毒的接毒时间toi为22～26h，例如可以是22h、23h、24h、25h、26h等，优选为24h。
21、优选地，所述ped病毒的接种量为0.03～0.1moi，例如可以是0.03moi、0.04moi、0.05moi、0.06moi、0.07moi、0.08moi、0.09moi、0.1moi等，优选为0.065moi。
22、优选地，接种ped病毒后培养的时间为54～96h，例如可以是54h、60h、66h、72h、78h、84h、90h、96h等，优选为72h。
23、在本专利技术中，补加新鲜培养基将细胞密度调整至合适范围后，此时记为病毒表达0h，并在病毒表达期间内每隔6h取样，使用nova检测细胞培养液的生化参数，并使用冰点渗透压仪检测培养液的渗透压值，优选ped病毒表达72h时收获。...
【技术保护点】
1.一种提高PED病毒表达的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的提高PED病毒表达的方法，其特征在于，所述渗透压值的调节范围为320～410mOsm/Kg，优选为350～370mOsm/Kg。
3.根据权利要求1或2所述的提高PED病毒表达的方法，其特征在于，所述调节培养基的渗透压值的方式为向培养基中添加氯化钠。
4.根据权利要求3所述的提高PED病毒表达的方法，所述培养基中氯化钠的浓度为0～10.0g/L，优选为0.3～1.0g/L。
5.根据权利要求1所述的提高PED病毒表达的方法，其特征在于，所述含ST细胞的培养基由以下步骤制备得到：
6.根据权利要求1-5任一项所述的提高PED病毒表达的方法，其特征在于，所述培养基为无血清CD ST培养基，优选为CD ST 258培养基。
7.根据权利要求5所述的提高PED病毒表达的方法，其特征在于，所述ST细胞的接种密度为0.3×106～4.0×106cells/mL，优选为1.0×106cells/mL。
8.根据权利要求
9.根据权利要求1所述的提高PED病毒表达的方法，其特征在于，所述PED病毒的接毒时间TOI为22～26h，优选为24h；
10.根据权利要求1所述的提高PED病毒表达的方法，其特征在于，所述PED病毒的表达完成后，PED病毒滴度为7.5Log(TCID50/mL)以上，优选为8.5Log(TCID50/mL)以上。
...【技术特征摘要】
1.一种提高ped病毒表达的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的提高ped病毒表达的方法，其特征在于，所述渗透压值的调节范围为320～410mosm/kg，优选为350～370mosm/kg。
3.根据权利要求1或2所述的提高ped病毒表达的方法，其特征在于，所述调节培养基的渗透压值的方式为向培养基中添加氯化钠。
4.根据权利要求3所述的提高ped病毒表达的方法，所述培养基中氯化钠的浓度为0～10.0g/l，优选为0.3～1.0g/l。
5.根据权利要求1所述的提高ped病毒表达的方法，其特征在于，所述含st细胞的培养基由以下步骤制备得到：
6.根据权利要求1-5任一项所述的提高ped病毒表达的方法，其特征在于，所述培养基为无血清cd st培养基，优选为...
【专利技术属性】
技术研发人员：贺笋，赵晓英，万国栋，寇春，张淑香，
申请(专利权)人：天康生物制药有限公司，
类型：发明
国别省市：
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