【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及用于标记生物样品中预定结构的标记物。本专利技术还涉及一种用于分析生物样品的方法。本专利技术还涉及一种用于分析生物样品的装置。
技术介绍
1、为了解决生命科学领域的关键问题，精确识别和定位生物样品(如组织样品或细胞培养物)中的某些结构是至关重要的。这可以通过将与特定结构(例如特定生物分子)结合的标记物引入样品中来完成。这些标记物通常包含附着于目标结构的亲和试剂和一种或多种荧光染料，所述荧光染料直接缀合于亲和试剂或通过其他方式附着于亲和试剂，例如通过次级亲和试剂。
2、例如，荧光显微镜允许以高空间分辨率对样品进行成像，但只涉及少量不同的荧光染料(通常在1-5种之间)。在同一实验中，可用的染料必须分布到所有被用于识别细胞类型的标记物、功能性标记物(如感兴趣的蛋白质)和一般的形态标记物中。这意味着在大多数成像实验中，细胞类型只能被少量地识别。虽然存在允许更可靠和稳健地鉴定细胞类型的现代方法，例如基于遗传调控网络(grn)的分析，但它们需要从样品中读出更高数量的不同标记物。
3、文件pct/ep2021/063310和pct/ep2021/073819各自提出了标记物和方法，其用于提高在单个荧光显微镜实验中可使用的标记物的数量。每个标记物包含构成代码的唯一的(unique)染料组合，所述代码原则上可识别相应的标记物。然而，仍然存在一些模糊性(ambiguities)，特别是当大量标记物彼此紧密邻近时。为了解决这些模糊性，有必要去除这些标记物，并用不同组的标记物重复采集图像。这一过程既耗时又昂贵。>
技术实现思路
1、本专利技术的目的由此是提供一种用于标记生物样品中预定结构的标记物、一种用于分析生物样品的方法和一种用于分析生物样品的装置，该装置能够以较低的成本和较少的时间可靠地识别大量的预定结构。
2、上述目的是通过独立权利要求的主题来实现的。优异的实施例在从属权利要求和以下描述中被限定。
3、所提出的用于标记生物样品中预定结构的标记物包含标记物基体。所述标记物基体具有：亲和试剂，该亲和试剂被配置为附着到所述样品的所述预定结构；和附着结构，该附着结构连接至所述亲和试剂，并且具有至少两个附着位点。所述附着结构包含至少一个切割位点，该切割位点被布置在所述至少两个附着位点之间。所述附着结构能够在所述至少一个切割位点处被切割试剂切割，以从所述标记物基体中去除至少一个附着位点。所述标记物还包含至少两个报告子，每个报告子都包含：接头结构，该接头结构具有互补附着位点，所述互补附着位点被配置为附着到所述附着位点中的一个附着位点；和至少两种不同荧光染料的组合，其被布置在所述接头结构上。所述染料组合对每个报告子是唯一的(unique)。所述互补附着位点对每个报告子是唯一的(unique)，并且被配置为使得每个报告子附着到所述标记物基体的不同附着位点。
4、特别地，所述亲和试剂可以是抗体、单结构域抗体(也被称为纳米抗体)、至少两种单结构域抗体的组合、适配体、寡核苷酸、吗啉诺(morpholino)、与预定rna、dna目标序列互补的pna、配体(例如药物或类药性分子)或毒素(例如鬼笔环肽(phalloidin)，一种与肌动蛋白纤维结合的毒素)。所述预定结构可以是特定的生物分子，例如蛋白质、rna序列、肽、dna序列、代谢物、激素、神经递质、维生素或微量营养素。所述预定结构也可以是单一分析物，例如金属离子，特别是重金属离子，如cd(ii)、co(ii)、pb(ii)、hg(ii)或u(vi)。
5、当所述标记物基体的所述亲和试剂被引入所述样品时，会将自身附着在所述预定结构。所述预定结构也称为分析物或目标或目标分子。由于所述亲和试剂连接至所述附着结构，因此所述附着结构也连接到了所述预定结构。由此，所述标记物基体可以将不同的所述报告子连接到所述预定结构。每种报告子都包含形成代码的唯一的染料组合，所述代码用于识别相应的所述报告子。由此，使得所述预定结构对荧光成像是可见的。
6、所述切割位点沿所述接头结构布置在所述附着位点之间。通过在所述切割位点处切割所述附着结构，将所述附着位点中的一个附着位点从所述附着结构中去除。当所述报告子中的一个报告子与所述被去除的附着位点相连接时，该报告子也被去除。这意味着被去除的报告子不再与所述预定结构相连，并且可以从所述样品中洗除。在洗除所述被去除的报告子后，与剩余附着位点相连接的另一个报告子可被引入所述样品。由此，所述标记物允许以基于循环或轮数的方式依次标记或编码所述预定结构。由此，第一轮标记中出现的模糊性可在后轮标记中被分辨，而无需去除或重新引入亲和试剂。这从而又减少了涉及大量标记物(即待识别的大量预定结构)的实验的成本和时间消耗。
7、在优选实施例中，所述接头结构由寡核苷酸或肽形成。所述接头结构连有所述荧光染料并使其连接至所述附着位点。荧光染料可以直接地(即共价地)或间接地(例如通过亲和标签-亲和配体组合)与所述接头结构偶联。所述接头结构本身可包括一个或多个寡核苷酸，例如dna、rna、lna、pna、吗啉诺或其他人工寡核苷酸。所述接头结构还可以包含肽或其他dna或rna类似物。类似的寡核苷酸和肽都可以通过标准化方法合成，以满足具体需求。因此，可以简单且经济地生产报告子。
8、在另一优选实施例中，所述切割位点是酶切割位点，并且所述附着结构能够在所述切割位点处被酶切割试剂切割。优选地，所述酶切割位点是限制性酶的靶标位点、crispr/cas靶标、重组酶靶标位点，特别是loxp位点、或flippase靶标位点、或caspase靶标位点。将所述酶切割试剂引入所述样品中，以从所述标记物中去除所述报告子中的一个或多个。所述酶切割试剂在所述切割位点切割所述附着结构后，所述附着结构被切割的部分和与附着结构的该部分相连接的报告子可以从所述样品中洗除。酶切割的优点是只针对所述切割位点，从而减少了对其他结构的破坏。
9、在另一优选实施例中，所述切割位点是光切割位点，并且所述附着位点能够通过光分解、特别是紫外光在所述切割位点切割所述附着结构。用光分解的手段切割所述附着结构非常高效，而且易于实现自动化。
10、在另一优选实施例中，所述附着位点和/或所述互补附着位点是寡核苷酸。寡核苷酸可容易地被制成唯一的条形码样结构。由此，每个附着位点及其相应的互补附着位点可被制成使得特定的报告子只能将自身附着在特定的附着位点。
11、本专利技术还涉及一种用于分析生物样品的方法，包括以下步骤：a)提供上述至少一种标记物。b)将标记物基体和第一报告子引入所述样品。c)将至少一种第一激发光引导至所述样品上，以激发所述第一报告子的荧光染料。d)由荧光生成至少一个第一读出，所述荧光是由位于所述样品的读出体积中的被激发的荧光染料发射的。e)将至少一种切割试剂引入所述样品，以从所述标记物基体中去除所述第一报告子。f)将第二报告子引入所述样品。g)将至少一种第二激发光引导至所述样品上，以激发所述第二报告子的所述荧光染料。h)由荧光生成至少本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种用于标记生物样品(702)中预定结构(102)的标记物(100)，包含：
2.根据权利要求1所述的标记物(100)，其中所述接头结构(116)由寡核苷酸或肽形成。
3.根据权利要求1或2中任一项所述的标记物(100)，其中所述切割位点(112a、112b)是酶切割位点(112a、112b)，并且所述附着结构(108)能够在所述切割位点(112a、112b)处被酶切割试剂切割。
4.根据权利要求3所述的标记物(100)，其中所述酶切割位点(112a、112b)是限制性酶的靶标位点、CRISPR/Cas靶标、重组酶的靶标位点，特别地为loxP位点、flippase靶标位点、或caspase靶标位点。
5.根据权利要求1或2中任一项所述的标记物(100)，其中所述切割位点(112a、112b)是光切割位点(112a、112b)，并且所述附着结构(108)能够在所述切割位点(112a、112b)处通过光分解、特别是紫外光切割。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的标记物(100)，其中所述附着位点(110a、110b、1
7.一种用于分析生物样品(702)的方法，包括以下步骤：
8.根据权利要求7所述的方法，还包括用交联剂将所述标记物(100)的亲和试剂(106)与预定结构(102)交联的步骤。
9.根据权利要求7或8中任一项所述的方法，其中生成所述第一和/或第二读出包括：将所述被激发的荧光染料(120a至120e)所发射的发射光拆分至多个检测通道中，
10.根据权利要求9所述的方法，其中所述标记物(100)被提供为使得所述第一和第二报告子(114a、114b、114c)的每种荧光染料分别对应于所述第一和第二读出的一个检测通道。
11.根据权利要求7至10中任一项所述的方法，其中所述报告子(114a、114b、114c)的全部荧光染料(120a至120e)被分为多组染料，
12.根据权利要求11所述的方法，其中在步骤c)和d)中，将所述第一激发光和第二激发光在时间上彼此相继依次被引导至所述样品(702)上。
13.根据权利要求7至12中任一项所述的方法，其中在将所述第二激发光引导至所述样品(702)上之前，将所述第一报告子(114a、114b、114c)从所述样品(702)中洗除。
14.根据权利要求7至13中任一项所述的方法，其中所述第一和/或第二读出包括所述读出体积的至少一个图像或所述读出体积的读出图像数据流。
15.根据权利要求7至14中任一项所述的方法，还包括捕获所述样品(702)的高光谱图像以生成所述第一和/或第二读出的步骤。
16.根据权利要求7至15中任一项所述的方法，还包括稳定至少一种荧光染料的所述荧光寿命的步骤，特别地通过包封、嵌入聚合物-基质和共结晶中的至少一种将所述荧光染料置于屏蔽环境中。
17.一种用于分析生物样品(702)的装置(700)，适于执行根据权利要求1至16中任一项所述的方法。
18.根据权利要求17所述的装置(700)，包括显微镜、读板仪、细胞仪、成像细胞仪或荧光激活细胞分选仪，其被配置为生成第一和第二读出。
19.根据权利要求17或18中任一项所述的装置(700)，被配置为确定以下中的至少一种：荧光染料(120a至120e)的荧光发射强度、荧光寿命、荧光寿命代表值、发射光谱、激发指纹和荧光各向异性。
...【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】
1.一种用于标记生物样品(702)中预定结构(102)的标记物(100)，包含：
2.根据权利要求1所述的标记物(100)，其中所述接头结构(116)由寡核苷酸或肽形成。
3.根据权利要求1或2中任一项所述的标记物(100)，其中所述切割位点(112a、112b)是酶切割位点(112a、112b)，并且所述附着结构(108)能够在所述切割位点(112a、112b)处被酶切割试剂切割。
4.根据权利要求3所述的标记物(100)，其中所述酶切割位点(112a、112b)是限制性酶的靶标位点、crispr/cas靶标、重组酶的靶标位点，特别地为loxp位点、flippase靶标位点、或caspase靶标位点。
5.根据权利要求1或2中任一项所述的标记物(100)，其中所述切割位点(112a、112b)是光切割位点(112a、112b)，并且所述附着结构(108)能够在所述切割位点(112a、112b)处通过光分解、特别是紫外光切割。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的标记物(100)，其中所述附着位点(110a、110b、110c)和/或所述互补附着位点(110a、110b、110c)是寡核苷酸。
7.一种用于分析生物样品(702)的方法，包括以下步骤：
8.根据权利要求7所述的方法，还包括用交联剂将所述标记物(100)的亲和试剂(106)与预定结构(102)交联的步骤。
9.根据权利要求7或8中任一项所述的方法，其中生成所述第一和/或第二读出包括：将所述被激发的荧光染料(120a至120e)所发射的发射光拆分至多个检测通道中，
10.根据权利要求9所述的方法，其中所述标记物(100)被提供为使得所述第一和第二报...
【专利技术属性】
技术研发人员：索伦·阿尔斯海默，凯·沃尔特，约阿希姆·布拉德尔，
申请(专利权)人：莱卡微系统CMS有限责任公司，
类型：发明
国别省市：
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