【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物，具体公开了一种异源二聚体膜蛋白离子通道细胞模型的制备方法。
技术介绍
1、心脏通过心肌细胞的节律性收缩和舒张而实现其泵血功能。心肌细胞膜的兴奋是触发心肌收缩的始动因素，其本质是在静息电位的基础上产生动作电位，其生物电的形成主要是由跨膜离子流导致。不同的离子电流协同作用了心脏动作电位，在动作电位中又包括去极化和复极化两大过程。细胞膜去极化期间，电压门控离子通道(voltage-gated ionchannels)的激活扮演极其重要的角色。电压门控钠(na+)、钙(ca++)与钾(k+)离子通道的协同作用，决定了心肌搏动动作电位，其中包含了窦房结与心肌收缩动作电位。
2、钠离子通道nav1.5表达于心肌细胞膜上，是心肌细胞中的重要钠通道，它的主要作用是心肌收缩冲动的传导。已知nav1.5主要是由α5亚单元(由scn5a基因编码)形成亲水性主孔，与辅助分子β1(由scn1b基因编码)亚单元以1：1或1：2以上比例，形成异源二聚体(heterodimer)或复合体。β与α亚单元相互作用，调节主孔离子通道动力学、门控、膜位面表达和电压依赖性。鉴于其在启动心肌动作电位的快速去极化方面的关键作用，scn5a突变通常会导致心率失常，例如第三类长q间隔症(lqt3)和原发性心室纤颤(ivf)。
3、由于缺乏scn5a与scn1b专一性抗体，无法利用重组蛋白亚单元专一性抗体获得不同nav1.5表型之细胞，导致了筛选nav1.5表型之细胞的困难。再者，钠离子通道nav1.5是药物研究中的一个重要靶点，构建一
技术实现思路
1、针对现有技术不足，本文公开了一种异源二聚体膜蛋白离子通道细胞模型的制备方法。本专利技术设计了一种经济且有效分析异源二聚体(及复合物)重组膜蛋白表达的方法。结合膜片钳技术操控细胞膜电位并监控细胞内电流，验证nav1.5通道的功能特性，获得具有正常生理功能的心肌钠离子通道nav1.5稳定表达细胞系，提供一种经济且可靠的细胞平台供临床前药物安全性筛选。
2、本专利技术包括以下技术方案：
3、一种异源二聚体膜蛋白离子通道细胞模型的制备方法，包括以下步骤：
4、1)载体构建一：将scn5a编码序列与cd8b1编码序列共同连接至载体1：所述scn5a编码序列的3‘端依次连接3xha标记、t2a肽、cd8b1、ires、杀稻瘟箘素抗药基因bsd与wpre；
5、2)载体构建二：将scn1b编码序列与cd8a编码序列共同连接至载体2：所述scn1b编码序列的3’端依次连接v5标记、t2a肽、cd8a、ires、嘌呤霉素抗药基因pac与wpre；
6、3)细胞膜表达：载体1与载体2共转表达细胞，在细胞膜表达蛋白cd8α/β与nav1.5钠离子通道；
7、4)nav1.5表达细胞单克隆筛选：利用限制稀释建立单克隆nav1.5细胞系，通过cd8α与β抗体染色结合流式细胞仪分析，筛选scn5a与scn1b表达量、比例不同的单细胞克隆。
8、上述技术方案的设计理由如下：报告基因(如，绿荧光蛋白、荧光素酶)重组蛋白表达一般以ires序列连接于目的重组蛋白基因序列下游，作为重组蛋白表达的标记；或者重组蛋白与报告基因蛋白之间利用2a肽相连，除了标记更进一步报告重组蛋白表达水平。但评估重组蛋白细胞膜上的表达水平，只能利用专一性重组蛋白抗体。对于异源多聚体(重组)蛋白而言，必须组合成多聚体始能稳定表达。再者，多种亚单元彼此间的表达比例决定多聚体重组蛋白复合物细胞膜表达的水平与正常生理功能。
9、细胞毒性t淋巴细胞(cytotoxic t lymphocyte,ctl)与辅助型t淋巴细胞(helpert lymphocyte)组成适应性免疫系统，在免疫系统在抵抗细菌、病毒等外来病原体感染以及杀伤肿瘤细胞等方面扮演重要角色。细胞毒性t淋巴细胞是在胸腺中发育，绝大多数表达α/β-t细胞受体(t cell receptor,tcr)，与辅助型t淋巴细胞不同的是它们表面表达的t细胞受体辅助受体是cd8而非cd4。辅助受体cd8作为细胞毒性t淋巴细胞表面分子，与t细胞受体协同辨识由第一类组织相容性蛋白(major histocompatibility complex class i,mhci)递呈的內/外源性抗原，并活化tcr下游信息传递令t细胞活化。cd8辅助受体是由α和β(或者α和α)两条多肽链组成的异(同)源二聚体，α和β链的分子量約为30至39(kilodalton,kda)。两条链依序(n端至c端)由细胞外域、疏水跨膜域与细胞内域组成。cd8α亚单元能以同源二聚体(homodimer)型态表达于细胞膜上。反之，单一cd8β分子必需与cd8α亚单元共表达形成异源二聚体(heterodimer)始能表达于细胞膜上。
10、本申请的专利技术人通过分析，结合cd8α/β和钠离子通道nav1.5的表达规律，将钠离子通道nav1.5活性亚基的表达与cd8α/β活性亚基的表达进行关联，形成上述的技术方案，形成一种经济且有效分析异源二(多)聚体重组膜蛋白表达的方法。
11、进一步的，上述一种异源二聚体膜蛋白离子通道细胞模型的制备方法，所述scn5a的编码序列如nm_000335.5所示；所述scn1b的编码序列如nm_001037.5所示。
12、进一步的，上述一种异源二聚体膜蛋白离子通道细胞模型的制备方法，所述scn5a的编码序列经过表达优化，如seq id no：1所示；所述scn1b的编码序列经过表达优化，如seq id no：2所示。
13、进一步的，上述一种异源二聚体膜蛋白离子通道细胞模型的制备方法,所述载体1和载体2为慢病毒载体，表达细胞为hek293t。
14、进一步的，上述一种异源二聚体膜蛋白离子通道细胞模型的制备方法,所述步骤4)nav1.5表达细胞单克隆筛选具体包括以下步骤：
15、表达细胞共感染后，利用分别位于两个载体上的杀稻瘟菌素bsd与嘌呤霉素pac抗药性基因富集共感染细胞；以cd8α/β于细胞膜上的表达量作为scn5a与scn1b于细胞膜上表达的分子数水平参考，利用限制稀释建立单克隆nav1.5细胞系，通过cd8α与β抗体染色结合流式细胞仪分析，筛选scn5a与scn1b表达量、比例不同的单细胞克隆。
16、进一步的，上述一种异源二聚体膜蛋白离子通道细胞模型的制备方法,还包括步骤5)离子通道nav1.5功能检测：
17、以cd8α与β表达量将单克隆细胞系区分为三大类，1、cd8αhicd8βhi；2、cd8αlocd8βhi；以及3、cd8αhicd8βlo；在电流钳制模式下，以固定电流量测钠离子通道所在细胞膜的两侧的电压值变化，挑选出符合人类心肌细胞nav1.5钠离子通道的生理特性的单克隆细胞。
18、另一方面，本专利技术还公开了一种电压依赖性心肌钠离子本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种异源二聚体膜蛋白离子通道细胞模型的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的一种异源二聚体膜蛋白离子通道细胞模型的制备方法，其特征在于，所述SCN5A的编码序列如NM_000335.5所示；所述SCN1B的编码序列如NM_001037.5所示。
3.根据权利要求1所述的一种异源二聚体膜蛋白离子通道细胞模型的制备方法，其特征在于，所述SCN5A的编码序列经过表达优化，如SEQ ID NO：1所示；所述SCN1B的编码序列经过表达优化，如SEQ ID NO：2所示。
4.根据权利要求1所述的一种异源二聚体膜蛋白离子通道细胞模型的制备方法，其特征在于，所述载体1和载体2为慢病毒载体，表达细胞为HEK293T。
5.根据权利要求1所述的一种异源二聚体膜蛋白离子通道细胞模型的制备方法，其特征在于，所述步骤4)Nav1.5表达细胞单克隆筛选具体包括以下步骤：
6.根据权利要求1所述的一种异源二聚体膜蛋白离子通道细胞模型的制备方法，其特征在于，还包括步骤5)离子通道Nav1.5功能检测：以Cd8α与β表达量
7.一种电压依赖性心肌钠离子通道细胞模型，其特征在于，由权利要求1-6任一项所述的方法制备获得。
8.如权利要求7所述的电压依赖性心肌钠离子通道细胞模型在临床前药物筛选中的用途。
9.如权利要求1-6任一项所述的方法在用于不同的异源二聚体重组膜蛋白表达和/或细胞系建立中的应用；所述不同指除了Nav1.5钠离子通道蛋白以外的异源二聚体重组膜蛋白。
10.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述异源二聚体膜蛋白包含亚基A和亚基B，以一亚基A与一个或以上的亚基B形成复合物。
...【技术特征摘要】
1.一种异源二聚体膜蛋白离子通道细胞模型的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的一种异源二聚体膜蛋白离子通道细胞模型的制备方法，其特征在于，所述scn5a的编码序列如nm_000335.5所示；所述scn1b的编码序列如nm_001037.5所示。
3.根据权利要求1所述的一种异源二聚体膜蛋白离子通道细胞模型的制备方法，其特征在于，所述scn5a的编码序列经过表达优化，如seq id no：1所示；所述scn1b的编码序列经过表达优化，如seq id no：2所示。
4.根据权利要求1所述的一种异源二聚体膜蛋白离子通道细胞模型的制备方法，其特征在于，所述载体1和载体2为慢病毒载体，表达细胞为hek293t。
5.根据权利要求1所述的一种异源二聚体膜蛋白离子通道细胞模型的制备方法，其特征在于，所述步骤4)nav1.5表达细胞单克隆筛选具体包括以下步骤：
6.根据权利要求1所述的一种异源二聚体膜蛋白...
【专利技术属性】
技术研发人员：李振诚，赖威仲，
申请(专利权)人：苏州启辰生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：
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