【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及基因工程，具体领域为一种勐腊病毒、勐腊病毒最小基因组系统和构建方法及其体外筛选或监测勐腊病毒预防或治疗药物中的应用。
技术介绍
1、勐腊病毒(mlav)在系统分类上属单股负链病毒目(mononegavirales)，丝状病毒科(filoviridae)，滇丝病毒属(dianlovirus)。丝状病毒是非节段，基因组为单股负链的rna病毒，其中以埃博拉属和马尔堡属为代表的病毒具有高致病性和高传染性，并通过人与人之间的接触迅速传播，对公共卫生健康和物种保护造成重大威胁。
2、埃博拉病毒粒子外形为丝状或杆状，可呈直线型杆状、长丝状、分枝形、u形和l形等多种形态，其中以分支形较为常见。埃博拉病毒的结构为长管状，直径大约50-80nm，长度在10000-14000nm之间，分子量为4.17×106，表面有囊膜(来自于宿主的细胞质膜)，其上有病毒衣壳蛋白形成的8-10nm长的纤突，内部有线性单股负链rna分子和结构蛋白组成的核衣壳。
3、
4、目前，国内还没有针对勐腊病毒的药物筛选和测试方法，勐腊病毒的全基因组尚未公开发表(专利技术人虽然曾于genebank中公布了登录号：nc_055510.1的勐腊病毒结构基因的序列，但是该序列未公开5’和3’末端序列，因为缺少末端序列，所以该序列无法用于构建最小基因组系统)，因此国内外的各家实验室均不具备开发筛药平台的先决条件。而且，勐腊病毒暂未分离出活病毒，且基于活病毒的药物筛选和测试操作繁琐、通量低、成本高。
技术实现思路
1、本专利技术的第一目的在于提供一种勐腊病毒。
2、本专利技术的第二目的在于提供一种勐腊病毒最小基因组系统和构建方法。
3、本专利技术的第三目的在于提供一种勐腊病毒最小基因组系统在体外筛选或监测勐腊病毒预防或治疗药物中的应用。
4、为实现上述目的，本专利技术提供如下技术方案：
5、一种勐腊病毒，其序列如seq id no：1所示。
6、一种勐腊病毒最小基因组系统，包括最小基因组质粒，所述最小基因组质粒包括勐腊病毒基因组3’leader和5’traile序列、np基因3’非编码区和l基因5’非编码区、gfp荧光报告基因或nanoluc荧光素酶报告基因，上述基因插入在包含t7真核启动子，hdv核酶和t7终止信号的pgem-3载体上。其中，勐腊病毒基因组序列如seq id no：1所示。
7、进一步的，包括pgem3-mgmlav-gfp质粒或pgem3-mgmlav-nluc质粒，序列分别如seq id no：2-3所示。
8、还包括辅助质粒，所述辅助质粒包括pcaggs-mlav-np质粒、pcaggs-mlav-vp30质粒、pcaggs-mlav-vp35质粒、pcaggs-mlav-l质粒及t7启动子表达质粒pcaggs-t7，序列分别如seq id no：4-8所示。
9、本专利技术所述的勐腊病毒最小基因组系统的构建方法，包括以下步骤：
10、(1)通过race技术获得mlav病毒全长基因组序列，序列如seq id no：1所示；
11、(2)构建含有gfp或nanoluc报告基因的勐腊病毒最小基因组质粒：将gfp或nanoluc报告基因替换mlav基因组的编码区，利用含有t7启动子的pgem-3载体构建表达质粒；
12、(3)构建最小基因组辅助质粒：将mlav病毒全长基因组中的np、vp35、vp30、l编码区及t7启动子构建到pcaggs表达载体上；
13、(4)将质粒进测序验证，质粒验证完成后通过质粒滴定获得最小基因组表达系统。
14、本专利技术所述的勐腊病毒最小基因组系统在体外筛选或监测勐腊病毒预防或治疗药物中的应用。
15、具体方法为，将勐腊病毒最小基因组及其辅助质粒转染细胞，并加入待筛选或监测的药物处理细胞，处理结束后监测gfp报告基因强度变化或化学发光强度。转染时，采用pgem3-mgmlav-gfp质粒或者pgem3-mgmlav-nluc质粒中的任一个与5个辅助质粒，共6个质粒进行共转染。
16、进一步的，所述药物的测试方法具体为，通过脂质体转染的方式将勐腊病毒最小基因组系统转染至细胞(例如：293t-17)，接种至96孔板，放置于浓度为5％ co2且在37℃温度条件下的细胞培养箱中培养24小时，移除含有质粒和转染试剂的细胞培养液，并加入含有药物的细胞培养液或只含有dmso的细胞培养液，放置于浓度为5％ co2且在37℃温度条件下的细胞培养箱中培养24小时；
17、移除含有药物的细胞培养液，使用pbs将细胞清洗一遍，观察细胞中gfp报告基因表达强度或使用nanoluc荧光素酶底物监测试剂盒测定细胞中的荧光素酶活性；
18、将实验组细胞中的gfp报告基因强度或荧光素酶活性与对照组比较，计算药物抑制效率；其中，根据荧光素酶活性计算药物抑制效率的计算公式为：抑制效率(％)＝(1-实验组荧光素酶活性/对照组荧光素酶活性)×100％。
19、与现有技术相比，本专利技术的有益效果是：
20、(1)本专利技术首次公开了勐腊病毒的全基因组序列，该序列含有5’和3’末端序列，因此可用于构建最小基因组系统。
21、(2)本专利技术开发了可以安全、高效的筛选和测试药物的系统和方法，可用于靶向勐腊病毒基因组复制和转录过程中参与的病毒蛋白和宿主因子的药物筛选和测试。由于实验过程中不涉及和不产生活病毒粒子，该系统可以在低生物安全等级实验室进行操作，比涉及活病毒粒子的操作更安全、方便且成本更低。
22、(3)本专利技术的最小基因组系统包括gfp报告基因和nanoluc荧光素酶报告基因，测试方便快捷，结果分析标准化，可以应用于高通量筛选。gfp荧光报告基因可以对药物进行可视化筛选，更加方便快捷；包含nanoluc荧光素酶报告基因的最小基因组系统则更加灵敏。两种含有不同报告基因的最小基因组系统可以满足不同需求的药物筛选模式，对于勐腊病毒的抗病毒药物筛选具有重要的应用价值，适用于大规模药物筛选，填补了当前针对新发蝙蝠丝状病毒勐腊病毒的药物筛选和测试的空白。
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1.一种勐腊病毒，其特征在于：其序列如SEQ ID NO：1所示。
2.一种勐腊病毒最小基因组系统，其特征在于：包括最小基因组质粒，所述最小基因组质粒包括勐腊病毒基因组3’Leader和5’Traile序列、NP基因3’非编码区和L基因5’非编码区、GFP荧光报告基因或Nanoluc荧光素酶报告基因，以及包含T7真核启动子、HDV核酶和T7终止信号的pGEM-3载体；其中，勐腊病毒基因组序列如SEQ ID NO：1所示。
3.根据权利要求2所述的勐腊病毒最小基因组系统，其特征在于：包括pGEM3-mgMLAV-GFP质粒或pGEM3-mgMLAV-Nluc质粒，序列分别如SEQ ID NO：2-3所示。
4.根据权利要求2所述的勐腊病毒最小基因组系统，其特征在于：还包括辅助质粒，所述辅助质粒包括pCAGGS-MLAV-NP质粒、pCAGGS-MLAV-VP30质粒、pCAGGS-MLAV-VP35质粒、pCAGGS-MLAV-L质粒及T7启动子表达质粒pCAGGS-T7，序列分别如SEQ ID NO：4-8所示。
5.权利要求2-4
6.权利要求2-4任一所述的勐腊病毒最小基因组系统在体外筛选或监测勐腊病毒预防或治疗药物中的应用。
7.根据权利要求6所述的勐腊病毒最小基因组系统在体外筛选或监测勐腊病毒预防或治疗药物中的应用，其特征在于：将勐腊病毒最小基因组及其辅助质粒转染细胞，并加入待筛选或监测的药物处理细胞，处理结束后监测GFP报告基因强度变化或化学发光强度。
8.根据权利要求7所述的勐腊病毒最小基因组系统在体外筛选或监测勐腊病毒预防或治疗药物中的应用，其特征在于：所述药物的测试方法具体为，通过脂质体转染的方式将勐腊病毒最小基因组系统转染至细胞，接种至96孔板，放置于浓度为5％CO2且在37℃温度条件下的细胞培养箱中培养24小时，移除含有质粒和转染试剂的细胞培养液，并加入含有药物的细胞培养液或只含有DMSO的细胞培养液，放置于浓度为5％CO2且在37℃温度条件下的细胞培养箱中培养24小时；
...【技术特征摘要】
1.一种勐腊病毒，其特征在于：其序列如seq id no：1所示。
2.一种勐腊病毒最小基因组系统，其特征在于：包括最小基因组质粒，所述最小基因组质粒包括勐腊病毒基因组3’leader和5’traile序列、np基因3’非编码区和l基因5’非编码区、gfp荧光报告基因或nanoluc荧光素酶报告基因，以及包含t7真核启动子、hdv核酶和t7终止信号的pgem-3载体；其中，勐腊病毒基因组序列如seq id no：1所示。
3.根据权利要求2所述的勐腊病毒最小基因组系统，其特征在于：包括pgem3-mgmlav-gfp质粒或pgem3-mgmlav-nluc质粒，序列分别如seq id no：2-3所示。
4.根据权利要求2所述的勐腊病毒最小基因组系统，其特征在于：还包括辅助质粒，所述辅助质粒包括pcaggs-mlav-np质粒、pcaggs-mlav-vp30质粒、pcaggs-mlav-vp35质粒、pcaggs-mlav-l质粒及t7启动子表达质粒pcaggs-t7，序列分别如seq ...
【专利技术属性】
技术研发人员：谢诗哲，杨兴娄，石正丽，
申请(专利权)人：中国科学院武汉病毒研究所，
类型：发明
国别省市：
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