【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生物，具体是一株植物乳杆菌乳糖透过酶缺失突变株δlacs1δlacs2及其应用。
技术介绍
1、植物乳杆菌是一种重要的益生菌，经常被用于富含乳糖的底物发酵。植物乳杆菌wcfs1(lactobacillus plantarum wcfs1)，其具有较强的乳糖代谢能力；益生菌中的乳糖代谢能力主要依赖于乳糖透过酶(lactose permease，lacs)，乳糖透过酶可以将乳糖转运到细胞膜内，再由β-半乳糖苷酶水解为半乳糖和葡萄糖，从而起到代谢乳糖的作用。
2、低聚半乳糖(galacto-oligosaccharide,gos)是在乳糖分子的半乳糖基侧以β-糖苷键的形式连接了1～7个半乳糖基形成的混合杂聚糖；作为一种新型功能性益生元，gos具有促进肠道双歧杆菌增殖、改善矿物质元素的吸收、改善脂质代谢、预防和治疗便秘等功能，利用安全、高效的β-d-半乳糖苷酶采用酶法合成gos近年来受到了广泛的关注。
3、母乳目前被认为是最好的婴幼儿营养剂，其和牛乳最重要的差别在于含寡糖的种类和结构的不同；母乳寡糖(human milk oligosaccharides,hmo)是只存在于母乳中的一种重要低聚糖，是母乳中仅次于脂肪和乳糖的第三大营养成分，在促进婴儿肠道菌群生长、完善免疫系统功能、以及促进大脑发育等方面发挥着不可替代的作用；迄今，已有多种方法提取或合成hmo，其中生物合成方法因不使用有毒试剂且方便大规模生产，常被用来合成多种hmo。
4、在低聚半乳糖或母乳寡糖的合成中，合成产物中仍然存在大
技术实现思路
1、针对现有技术的不足，本专利技术提供了一株植物乳杆菌乳糖透过酶缺失突变株δlacs1δlacs2及其应用，通过基因敲除获得一株植物乳杆菌乳糖透过酶lacs1和乳糖透过酶lacs2缺失突变株，该突变株仍然能够利用乳糖、葡萄糖和半乳糖进行生长，但是不能利用低聚半乳糖和母乳寡糖，可将该菌株用于低聚半乳糖和母乳寡糖等益生元的纯化工作。
2、本专利技术技术方案如下：
3、一株植物乳杆菌乳糖透过酶缺失突变株δlacs1δlacs2，缺失植物乳杆菌wcfs1中的乳糖透过酶编码基因lacs1和乳糖透过酶编码基因lacs2；其中，所述lacs1的核苷酸序列如seq id no.1所示，所述lacs2的核苷酸序列如seq id no.2所示。
4、我们对植物乳杆菌wcfs1菌株进行研究，首次发现了植物乳杆菌wcfs1中含有两种具有乳糖基底物转运作用的酶，为了研究两种酶的具体生物学活性，拟敲除两种酶的编码基因，验证敲除后的突变株对各种糖的利用效果；研究发现，所述两种酶在低聚半乳糖和母乳寡糖的利用中起到不可或缺的作用，我们将两种酶分别命名为乳糖透过酶lacs1和乳糖透过酶lacs2，并将其编码基因分别命名为lacs1和lacs2；其中，所述乳糖透过酶lacs1的氨基酸序列如seq id no.15所示，乳糖透过酶lacs2的氨基酸序列如seq id no.16所示。
5、优选的，所述植物乳杆菌乳糖透过酶缺失突变株δlacs1δlacs2，构建方法包括如下步骤：
6、(1)使用温度敏感质粒pg+host9，分别将靶基因lacs1和lacs2的上游同源臂和下游同源臂扩增、融合并连接到质粒中，得重组质粒；
7、(2)将步骤(1)中的重组质粒电转化至植物乳杆菌wcfs1进行基因敲除，得敲除后的突变株；
8、(3)通过pcr和测序技术对步骤(2)中的突变株进行敲除情况验证，得植物乳杆菌乳糖透过酶缺失突变株△lacs1△lacs2。
9、优选的，所述步骤(1)中的lacs1上游同源臂扩增所用引物为lacs1-up-f和lacs1-up-r，其序列分别如seq id no.3和seq id no.4所示；lacs1下游同源臂扩增所用引物为lacs1-down-f和lacs1-down-r，其序列分别如seq id no.5和seq id no.6所示。
10、优选的，所述步骤(1)中的lacs2上游同源臂扩增所用引物为lacs2-up-f和lacs2-up-r，其序列分别如seq id no.7和seq id no.8所示；lacs2下游同源臂扩增所用引物为lacs2-down-f和lacs2-down-r，其序列分别如seq id no.9和seq id no.10所示。
11、优选的，所述步骤(1)中的融合方法为重叠延伸pcr法。
12、优选的，所述步骤(3)中pcr验证lacs1敲除情况所用引物为lacs1-test-f和lacs1-test-r，其序列分别如seq id no.11和seq id no.12所示；
13、优选的，所述步骤(3)中pcr验证lacs2敲除情况所用引物为lacs2-test-f和lacs2-test-r；其序列分别如seq id no.13和seq id no.14所示。
14、所述植物乳杆菌乳糖透过酶缺失突变株δlacs1δlacs2在益生元纯化中的应用。
15、优选的，所述益生元为低聚半乳糖或母乳寡糖。
16、基因lacs1和/或基因lacs2在糖代谢中的应用，所述lacs1的核苷酸序列如seq idno.1所示，所述lacs2的核苷酸序列如seq id no.2所示。
17、优选的，基因lacs1和/或基因lacs2在糖代谢中的应用，应用方法是将菌株中的lacs1和/或lacs2敲除后制备得工程菌，利用所述工程菌提纯低聚半乳糖或母乳寡糖。
18、有益效果：
19、本专利技术首次发现了植物乳杆菌wcfs1中存在的两种乳糖透过酶lacs1和lacs2，并提供了一株植物乳杆菌乳糖透过酶缺失突变株δlacs1δlacs2，缺失乳糖透过酶lacs1和乳糖透过酶lacs2；该突变株仍然能够利用乳糖、葡萄糖和半乳糖进行生长，但是不能利用低聚半乳糖和母乳寡糖，可将该菌株用于低聚半乳糖和母乳寡糖等益生元的纯化工作，便捷有效且操作成本低。
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1.一株植物乳杆菌乳糖透过酶缺失突变株ΔlacS1ΔlacS2，其特征在于，缺失植物乳杆菌WCFS1中的乳糖透过酶编码基因lacS1和乳糖透过酶编码基因lacS2；其中，所述lacS1的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述lacS2的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
2.如权利要求1所述的ΔlacS1ΔlacS2，其特征在于，构建方法包括如下步骤：
3.如权利要求2所述的ΔlacS1ΔlacS2，其特征在于，所述步骤(1)中的lacS1上游同源臂扩增所用引物为lacS1-Up-F和lacS1-Up-R，其序列分别如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示；lacS1下游同源臂扩增所用引物为lacS1-Down-F和lacS1-Down-R，其序列分别如SEQ IDNO.5和SEQ ID NO.6所示。
4.如权利要求2所述的ΔlacS1ΔlacS2，其特征在于，所述步骤(1)中的lacS2上游同源臂扩增所用引物为lacS2-Up-F和lacS2-Up-R，其序列分别如SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8所示；
5.如权利要求2所述的ΔlacS1ΔlacS2，其特征在于，所述步骤(3)中PCR验证lacS1敲除情况所用引物为lacS1-Test-F和lacS1-Test-R，其序列分别如SEQ ID NO.11和SEQ IDNO.12所示。
6.如权利要求2所述的ΔlacS1ΔlacS2，其特征在于，所述步骤(3)中PCR验证lacS2敲除情况所用引物为lacS2-Test-F和lacS2-Test-R；其序列分别如SEQ ID NO.13和SEQ IDNO.14所示。
7.权利要求1所述植物乳杆菌乳糖透过酶缺失突变株ΔlacS1ΔlacS2在益生元纯化中的应用。
8.如权利要求7所述的应用，其特征在于，所述益生元为低聚半乳糖或母乳寡糖。
9.基因lacS1和/或基因lacS2在糖代谢中的应用，所述lacS1的核苷酸序列如SEQ IDNO.1所示，所述lacS2的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
10.如权利要求9所述的应用，其特征在于，应用方法是将菌株中的lacS1和/或lacS2敲除后制备得工程菌，利用所述工程菌提纯低聚半乳糖或母乳寡糖。
...【技术特征摘要】
1.一株植物乳杆菌乳糖透过酶缺失突变株δlacs1δlacs2，其特征在于，缺失植物乳杆菌wcfs1中的乳糖透过酶编码基因lacs1和乳糖透过酶编码基因lacs2；其中，所述lacs1的核苷酸序列如seq id no.1所示，所述lacs2的核苷酸序列如seq id no.2所示。
2.如权利要求1所述的δlacs1δlacs2，其特征在于，构建方法包括如下步骤：
3.如权利要求2所述的δlacs1δlacs2，其特征在于，所述步骤(1)中的lacs1上游同源臂扩增所用引物为lacs1-up-f和lacs1-up-r，其序列分别如seq id no.3和seq id no.4所示；lacs1下游同源臂扩增所用引物为lacs1-down-f和lacs1-down-r，其序列分别如seq idno.5和seq id no.6所示。
4.如权利要求2所述的δlacs1δlacs2，其特征在于，所述步骤(1)中的lacs2上游同源臂扩增所用引物为lacs2-up-f和lacs2-up-r，其序列分别如seq id no.7和seq id no.8所示；lacs2下游同源臂扩增所用引物为lacs2-down-f和lacs2-down-r，其序列分...
【专利技术属性】
技术研发人员：张夙夙，李金铭，代美学，徐振上，
申请(专利权)人：山东师范大学，
类型：发明
国别省市：
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