【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于酶活性检测，具体涉及一种基于一维hnca核磁共振检测支链氨基酸氨基转移酶活性的方法及应用。
技术介绍
1、支链氨基酸氨基转移酶（branched-chain aminotransferases，简称bcats）是通过α-酮戊二酸（α-ketoglutarate，简称α-kg）作为α-氨基的受体来催化必需支链氨基酸（branched-chain amino acids，简称bcaas）分解代谢，生成支链酮酸（参考图1），bcaas包括缬氨酸（valine）、亮氨酸（leucine）和异亮氨酸（isoleucine）等。bcats包含两种已知的同工酶bcat1和bcat2，bcat1存在于胞浆，bcat2是线粒体蛋白。从组织分布来看，bcat2的表达几乎无处不在，但bcat1的表达仅局限于特定器官或组织，包括大脑。bcats是缬氨酸（valine）、亮氨酸（leucine）和异亮氨酸（isoleucine）第一步分解代谢的重要参与酶，与多种疾病息息相关。
2、bcats在许多类型肿瘤中过表达，包括原发性胶质母细胞瘤、乳腺癌症、急性髓细胞白血病、非小细胞肺癌、前列腺癌症，并在肿瘤发生和肿瘤代谢中发挥着至关重要的作用。bcats在支链氨基酸氨基转移过程中，提供氨基，因此氮通过该机制在全身移动，用于合成非必需氨基酸。支链氨基酸分解代谢的途径失调经常导致神经功能障碍。众所周知，支链氨基酸，尤其是亮氨酸，通过激活mtor信号通路，促进肌肉蛋白合成或防止其分解或两者兼有，对蛋白质的合成代谢产生作用。bcaas除了对运动
3、目前，有几种不同的高通量筛选（hts）方法被开发用于寻找bcats的小分子抑制剂。该方法利用亮氨酸脱氢酶（leudh）催化bcats的产物-酮亮氨酸还原为亮氨酸时，所消耗的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（nadh）的量检测bcats的酶活性。因为检测的nadh不是bcats的直接产物，所以需要排除由偶联酶反应引起的假阳性和假阴性。另外，利用液相色谱质谱联用技术定量检测bcats的直接产物酮亮氨酸的方法，灵敏度较高，但在保存时间上有变化，为了判断是否是酮亮氨酸，每次都得利用标准品进行判断，而且需要优化样品去除额外成分。并且，上述方法需要预处理样品再进行检测，无法实时监测酶反应。
4、由于以上方法都存在相应的局限性，故需要建立更准确和简便的，且能够实时监测酶活性，以及用于抑制剂筛查的方法。
技术实现思路
1、鉴于上述现有技术的不足，本专利技术的目的在于提供一种基于一维hnca核磁共振检测支链氨基酸氨基转移酶活性的方法及应用，旨在解决现有检测方法存在检测过程复杂，且无法实时监测bcats的活性的问题。
2、本专利技术的第一方面，提供一种基于一维hnca核磁共振检测支链氨基酸氨基转移酶活性的方法，其中，包括：
3、步骤s10、配制待测样品，所述待测样品包括碳13和氮15共价链接的支链氨基酸、α-酮戊二酸和支链氨基酸氨基转移酶；
4、步骤s11、将所述待测样品进行温育，利用一维hnca核磁共振在不同时间点对所述待测样品进行检测，得到不同时间点的待测样品的一维hnca氢谱信号峰的面积；
5、步骤s12、配制多个标准样品，所述标准样品包括已知浓度的碳13和氮15共价链接的支链氨基酸，不同标准样品中的碳13和氮15共价链接的支链氨基酸的浓度不同；
6、利用一维hnca核磁共振对所述标准样品进行检测，得到标准样品的一维hnca氢谱信号峰的面积，根据所述标准样品的一维hnca氢谱信号峰的面积和所述标准样品中的碳13和氮15共价链接的支链氨基酸的浓度，得到标准曲线；
7、步骤s13、根据所述不同时间点的待测样品的一维hnca氢谱信号峰的面积和所述标准曲线，得到不同时间点的待测样品中的碳13和氮15共价链接的支链氨基酸的浓度，根据所述浓度计算得到支链氨基酸氨基转移酶的活性值。
8、可选地，所述步骤s10中，所述碳13和氮15共价链接的支链氨基酸为碳13和氮15共价链接的亮氨酸、碳13和氮15共价链接的异亮氨酸、碳13和氮15共价链接的缬氨酸中的一种。
9、可选地，所述步骤s10中，所述待测样品通过在反应缓冲液中加入碳13和氮15共价链接的支链氨基酸、α-酮戊二酸和支链氨基酸氨基转移酶配制得到；
10、所述待测样品中，所述碳13和氮15共价链接的支链氨基酸的浓度为0.01~50mm，所述α-酮戊二酸的浓度为0.01~50mm，所述支链氨基酸氨基转移酶的浓度为0.01μm~100μm。
11、可选地，所述步骤s11中，所述温育的温度为25~40℃。
12、可选地，所述步骤s11中，所述不同时间点分别为自温育开始后的5min、30min、1h、2h、3h、4h、6h、8h中的任意两个时间点。
13、可选地，所述步骤s12中，所述标准样品通过在反应缓冲液中加入已知浓度的碳13和氮15共价链接的支链氨基酸配制得到。
14、可选地，所述步骤s13中，根据所述浓度计算得到支链氨基酸氨基转移酶的活性值的步骤具体包括：
15、根据所述不同时间点中两个时间点的待测样品中的碳13和氮15共价链接的支链氨基酸的浓度，得到对应反应时间的碳13和氮15共价链接的支链氨基酸的浓度差；
16、根据所述碳13和氮15共价链接的支链氨基酸的浓度差、反应时间和下式方程，计算得到支链氨基酸氨基转移酶的活性值；
17、支链氨基酸氨基转移酶的活性值= 碳13和氮15共价链接的支链氨基酸浓度差/反应时间；
18、其中，支链氨基酸氨基转移酶活性值的单位为纳摩尔/毫升/分钟，碳13和氮15共价链接的支链氨基酸浓度差的单位为纳摩尔/毫升，反应时间的单位为分钟。
19、本专利技术的第二方面，提供一种本专利技术所述的方法在支链氨基酸氨基转移酶抑制剂筛选中的应用。
20、可选地，所述支链氨基酸氨基转移酶抑制剂为bay-069，所述bay-069的casno.2639638-66-5。
21、本专利技术具有以下有益效果：本专利技术利用一维hnca核磁共振选择性以及特异性地检测碳13和氮15共价链接的支链氨基酸的氢谱信号，根据该支链氨基酸的氢谱信号与标准曲线，计算出bca本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种基于一维HNCA核磁共振检测支链氨基酸氨基转移酶活性的方法，其特征在于，包括：
2.根据权利要求1所述的基于一维HNCA核磁共振检测支链氨基酸氨基转移酶活性的方法，其特征在于，所述步骤S10中，所述碳13和氮15共价链接的支链氨基酸为碳13和氮15共价链接的亮氨酸、碳13和氮15共价链接的异亮氨酸、碳13和氮15共价链接的缬氨酸中的一种。
3.根据权利要求1所述的基于一维HNCA核磁共振检测支链氨基酸氨基转移酶活性的方法，其特征在于，所述步骤S10中，所述待测样品通过在反应缓冲液中加入碳13和氮15共价链接的支链氨基酸、α-酮戊二酸和支链氨基酸氨基转移酶配制得到；
4.根据权利要求1所述的基于一维HNCA核磁共振检测支链氨基酸氨基转移酶活性的方法，其特征在于，所述步骤S11中，所述温育的温度为25 ~ 40℃。
5.根据权利要求1所述的基于一维HNCA核磁共振检测支链氨基酸氨基转移酶活性的方法，其特征在于，所述步骤S11中，所述不同时间点分别为自温育开始后的5min、30min、1h、2h、3h、4h、6h、8h中的任意两个
6.根据权利要求1所述的基于一维HNCA核磁共振检测支链氨基酸氨基转移酶活性的方法，其特征在于，所述步骤S12中，所述标准样品通过在反应缓冲液中加入已知浓度的碳13和氮15共价链接的支链氨基酸配制得到。
7.根据权利要求1所述的基于一维HNCA核磁共振检测支链氨基酸氨基转移酶活性的方法，其特征在于，所述步骤S13中，根据所述浓度计算得到支链氨基酸氨基转移酶的活性值的步骤具体包括：
8.一种权利要求1-7任一项所述的方法在支链氨基酸氨基转移酶抑制剂筛选中的应用。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述支链氨基酸氨基转移酶抑制剂为BAY-069，所述BAY-069的CAS No.2639638-66-5。
...【技术特征摘要】
1.一种基于一维hnca核磁共振检测支链氨基酸氨基转移酶活性的方法，其特征在于，包括：
2.根据权利要求1所述的基于一维hnca核磁共振检测支链氨基酸氨基转移酶活性的方法，其特征在于，所述步骤s10中，所述碳13和氮15共价链接的支链氨基酸为碳13和氮15共价链接的亮氨酸、碳13和氮15共价链接的异亮氨酸、碳13和氮15共价链接的缬氨酸中的一种。
3.根据权利要求1所述的基于一维hnca核磁共振检测支链氨基酸氨基转移酶活性的方法，其特征在于，所述步骤s10中，所述待测样品通过在反应缓冲液中加入碳13和氮15共价链接的支链氨基酸、α-酮戊二酸和支链氨基酸氨基转移酶配制得到；
4.根据权利要求1所述的基于一维hnca核磁共振检测支链氨基酸氨基转移酶活性的方法，其特征在于，所述步骤s11中，所述温育的温度为25 ~ 40℃。
5.根据权利要求1所述的基于一维hnca核磁共振检测支链...
【专利技术属性】
技术研发人员：李琰，文赫，时展，韦青燕，刘丽，何芸，史菲，崔惠娜，王娇娇，
申请(专利权)人：哈尔滨脉图精准技术有限公司，
类型：发明
国别省市：
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