【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物，涉及猪δ冠状病毒，特别是指一种猪δ冠状病毒突变体病毒rpdcov及其拯救方法和应用。
技术介绍
1、猪δ冠状病毒（porcine deltacoronavirus，pdcov）是δ冠状病毒属中唯一能够感染哺乳动物的猪肠道冠状病毒，可引起10日龄以内的新生仔猪急性腹泻和死亡，病死率超过80%，是规模化养猪场中极易发生，且影响仔猪生长速率的主要病原体。另外，pdcov具有跨种感染能力，可以感染7个种属的22种细胞系。2021年nature报道，从海地三名发热儿童的血清样本中检测并分离出变异株hu-pdcov，表明pdcov具有感染人的风险。因此，如何有效防控pdcov是我国畜牧业与社会发展亟待解决的重要问题。但是，目前仍缺少可用的商品化的疫苗来防控pdcov感染，研制新一代疫苗仍然迫在眉睫。pdcov的基因组rna全长约25knt，基因组序列为5’utr-orf1a-orf1b-s-e-m-ns6-ns7-n-3’utr，分别编码两个大的多聚蛋白pp1a和pp1ab，刺突蛋白s、小膜蛋白e、膜蛋白m、辅助蛋白ns6、ns7、ns7a和核衣壳蛋白n。其中，s蛋白在病毒与细胞受体结合，在介导病毒入侵和感染中发挥重要作用，s蛋白某些氨基酸位点的突变，可能会使病毒在细胞中的生物学特征发生重大改变，从而为抗病毒疫苗的研发提供参考。
2、反向遗传学（reverse genetics）是通过构建病毒cdna感染性克隆，实现在dna水平对病毒基因组进行编辑，进而拯救重组病毒，探索病毒基因功能和生物学特性，被广泛用于病
技术实现思路
1、本专利技术提出一种猪δ冠状病毒突变体病毒rpdcov及其拯救方法和应用，本专利技术为pdcov的病毒致病机制研究、疫苗开发提供了平台支撑，也为研究冠状病毒各种蛋白功能提供新思路。
2、本专利技术的技术方案是这样实现的：
3、本专利技术提出了一种猪δ冠状病毒突变体病毒rpdcov以及拯救方法与应用，通过将pdcov hnzk-02株的s蛋白第173位丝氨酸s和第179位酪氨酸y分别突变为脯氨酸p和半胱氨酸c，然后将突变后的病毒基因组克隆到pgf载体上，该感染性克隆拯救出的猪δ冠状病毒突变体病毒rpdcov感染llc-pk1细胞后能引起细胞病变，且与pdcov野生毒株相比，其在细胞上的复制能力增强，对仔猪的致病性减弱。该突变体病毒rpdcov为猪δ冠状病毒新型弱毒疫苗的研发提供了新的工具。
4、具体来说：
5、本申请提供了一种猪δ冠状病毒突变体病毒rpdcov，所述突变体与pdcov野生毒株相比氨基酸突变位点为s173→p和y179→c。
6、上述猪δ冠状病毒突变体病毒rpdcov的基因组序列如seq id no.19所示。
7、一种猪δ冠状病毒突变体病毒rpdcov感染性克隆的构建方法，步骤如下：
8、（1）以猪δ冠状病毒的反转录产物cdna为模板、序列表中seq id no.1-seq idno.12所示序列为各片段扩增引物，扩增猪δ冠状病毒a-f片段，其中在a片段5’端首位插入t7启动子序列，f片段3’端末端插入 ascⅰ酶切位点序列，引物e-r和f-f包含突变体病毒rpdcov s蛋白氨基酸s173→p和y179→c突变位点，引物序列如序列表中seq id no.10、seqid no.11所示；
9、（2）以pgf载体为模板，seq id no.13-seq id no.16所示序列为引物，对pgf载体进行分段扩增，得到线性化pgf载体的g1和g2片段，pgf载体的核苷酸序列如seq id no.20所示；
10、（3）在yepd固体培养基上划线接种酿酒酵母vl6-48n，挑取单菌落到yepd液体培养基中扩大培养，菌液中加入藤黄节杆菌酶（20t）和β-巯基乙醇裂解酵母细胞壁，制备酵母感受态细胞；
11、（4）将步骤（2）的g1片段和g2片段等比例混合，所得混合物与步骤（1）的a-f片段按1:1:1:1:1:1:1的质量比混合均匀，共转化至vl6-48n酵母感受态细胞中，将转化后的酵母细胞涂布于组氨酸（his）缺陷型固体培养基表面，待长出合适大小的乳白色菌落后，进行菌液pcr和核酸测序筛选出阳性cdna感染性克隆，将最终确定的阳性克隆质粒用电转化法转化至epi300大肠杆菌感受态细胞，进行大量扩增，获得足量的cdna感染性克隆质粒，即猪δ冠状病毒cdna感染性克隆。
12、利用上述猪δ冠状病毒突变体病毒rpdcov cdna感染性克隆的构建方法构建得到的猪δ冠状病毒突变体病毒rpdcov cdna感染性克隆。
13、上述猪δ冠状病毒突变体病毒rpdcov 感染性cdna克隆在拯救病毒中的应用。
14、进一步的，利用美国bio-rad公司生产的电转仪将权利要求8所述猪δ冠状病毒的全长mrna和猪δ冠状病毒n蛋白的mrna共转染llc-pk1细胞，当出现典型病变时收取病毒上清液，获得拯救的突变体病毒rpdcov。
15、上述的猪δ冠状病毒突变体病毒rpdcov在制备预防猪δ冠状病毒新型疫苗中的应用。
16、本专利技术具有以下有益效果：
17、与pdcov野生毒株相比，本专利技术提供了一种猪δ冠状病毒突变体病毒rpdcov，具有以下优势：
18、（1）本专利技术利用基因工程方法，对pdcov野生毒株基因组进行改造，改造的氨基酸位点为病毒s蛋白s173→p和y179→c，将改造后的病毒基因组克隆到pgf载体上，通过单酶切，体外转录以及电转染llc-pk1细胞，成功拯救出猪δ冠状病毒突变体病毒rpdcov。对突变体病毒rpdcov感染llc-pk1细胞后进行tcid50测定；对感染突变体病毒rpdcov的仔猪肠道进行病理切片检查。结果表明：拯救出的突变体病毒rpdcov滴度为3.73*108tcid50/ml，感染仔猪肠道后，其致病性相较于pdcov野毒感染组减弱，相比pdcov野生毒株其生物学特性发生了改变。
19、（2）本专利技术提供的感染性cdna克隆构建方法具有快捷、稳定、高效等优势。本专利技术将pdcov hnzk-02株生物基因组分为6个片段，基于酵母转化相关同源重组的方法一步得到感染性克隆，避免了传统反向遗传学技术中需要将病毒基因组各片段逐一连接，也避免了传统的连接方法中酶切连接效率低下的问题，大大提高了连接效率。
20、（3）本专利技术提供的t7本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种猪δ冠状病毒突变体病毒rPDCoV，其特征在于：所述猪δ冠状病毒突变体病毒rPDCoV与PDCoV野毒S蛋白相比氨基酸突变位点为S173→P和Y179→C。
2.根据权利要求1所述的猪δ冠状病毒突变体病毒rPDCoV，其特征在于：所述猪δ冠状病毒突变体病毒rPDCoV的基因组序列如SEQ ID No.19所示。
3.一种猪δ冠状病毒突变体病毒rPDCoV感染性克隆的构建方法，其特征在于，步骤如下：
4.根据权利要求3所述的猪δ冠状病毒突变体病毒rPDCoV感染性克隆的构建方法，其特征在于：所述步骤（1）中猪δ冠状病毒为PDCoV HNZK-02毒株；获得的A-F片段中的A片段的5’端首位插入了T7启动子序列、F片段的3’端末端插入了ASCⅠ酶切位点序列。
5.根据权利要求3所述的猪δ冠状病毒突变体病毒rPDCoV感染性克隆的构建方法，其特征在于：所述步骤（2）中pGF载体的核苷酸序列如SEQ ID No.20所示。
6.根据权利要求5所述的猪δ冠状病毒突变体病毒rPDCoV感染性克隆的构建方法，其特征在于：所述步
7.利用权利要求3-6任一项所述的方法构建的猪δ冠状病毒突变体病毒rPDCoVrPDCoV感染性克隆。
8.权利要求7所述的猪δ冠状病毒突变体病毒rPDCoVrPDCoV感染性克隆在病毒拯救中的应用。
9.根据权利要求8的应用，其特征在于，步骤为：
10.权利要求1所述的猪δ冠状病毒突变体病毒rPDCoV在制备预防猪δ冠状病毒新型疫苗中的应用。
...【技术特征摘要】
1.一种猪δ冠状病毒突变体病毒rpdcov，其特征在于：所述猪δ冠状病毒突变体病毒rpdcov与pdcov野毒s蛋白相比氨基酸突变位点为s173→p和y179→c。
2.根据权利要求1所述的猪δ冠状病毒突变体病毒rpdcov，其特征在于：所述猪δ冠状病毒突变体病毒rpdcov的基因组序列如seq id no.19所示。
3.一种猪δ冠状病毒突变体病毒rpdcov感染性克隆的构建方法，其特征在于，步骤如下：
4.根据权利要求3所述的猪δ冠状病毒突变体病毒rpdcov感染性克隆的构建方法，其特征在于：所述步骤（1）中猪δ冠状病毒为pdcov hnzk-02毒株；获得的a-f片段中的a片段的5’端首位插入了t7启动子序列、f片段的3’端末端插入了ascⅰ酶切位点序列。
5.根据权利要求3所述的猪δ冠状病毒突变体病毒rpd...
【专利技术属性】
技术研发人员：魏战勇，祖少坡，胡慧，袁晋，史晨曦，张红垒，张钰灿，靳晓慧，
申请(专利权)人：河南农业大学，
类型：发明
国别省市：
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