【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及分子生物学。更具体地，涉及禽白血病病毒6个亚群的多重pcr检测的引物探针组、试剂盒及方法。
技术介绍
1、禽白血病病毒(avian leukosis virus，alv)属于反转录病毒科α反转录病毒属成员，感染禽类能够引起多种肿瘤性疾病，如淋巴细胞瘤、髓细胞瘤、血管瘤等。根据病毒囊膜蛋白gp85基因序列差异、病毒干扰实验及宿主范围，alv可分为a～k共11个亚群(alv-a～k)。自然感染鸡的有a～e和j共6个亚群，其中，alv-e为内源性病毒，对鸡不致病或致病性很弱；alv-a和alv-b在中国不同类型鸡群中普遍存在；alv-c和alv-d自然感染病例较少；alv-j与其它亚群病毒抗原性差异最大，且致病性和传染性最强，是发病鸡群中分离率最高的亚群。实际上，大多数感染鸡仅表现亚临床症状，包括免疫抑制、生长迟缓、产蛋下降等。alv感染后带来的经济损失严重危害了中国养鸡业的健康发展。由于目前没有商业化疫苗和药物可用，只能从源头上阻断病毒的传播，因此，必须加强外源性alv的检测，及时检测并淘汰感染或者疑似感染鸡，才能有效控制外源性alv。
2、禽白血病属于垂直传播性疾病，控制该病最有效的措施是及时对鸡群进行检测，淘汰阳性鸡，净化和消除鸡群中的外源性alv，建立无外源性alv感染的种鸡核心群。因此，高效、快速、便捷的检测方法有利于控制alv的传播。国内外对alv的检测和鉴定方法主要有病毒分离、elisa、间接免疫荧光试验、pcr等。病毒分离方法最可靠，但检测周期长，需要与其它方法配合才能鉴定亚群；群特异性抗原e
3、因此，需要提供一种能同时检测禽白血病多个亚群的检测试剂，以解决上述问题。
技术实现思路
1、本专利技术的一个目的在于提供一种禽白血病病毒6个亚群的多重pcr检测的引物探针组及试剂盒，可对alv-a/b/c/d/e/j 6个亚群禽白血病病毒alv-a/b/c/d/e/j进行快速、准确分型，灵敏度高，特异性强。
2、本专利技术的另一个目的在于提供一种同时检测禽白血病病毒alv-a/b/c/d/e/j 6个亚群的方法，可通过2管四重的pcr实验结果同时检测alv-a/b/c/d/e/j 6个亚群，提早进行种鸡隔离，减少经济损失。
3、为达到上述目的，本专利技术采用下述技术方案：
4、本专利技术首先提供了一种禽白血病病毒6个亚群的多重pcr检测的引物探针组，包括：
5、用于检测禽白血病病毒alv-a亚群的seq id no.1所示的上游引物a1和seq idno.2所示的下游引物a2及seq id no.3所示的探针a3；
6、用于检测禽白血病病毒alv-b亚群的seq id no.4所示的上游引物b1和seq idno.5所示的下游引物b2及seq id no.6所示的探针b3；
7、用于检测禽白血病病毒alv-c亚群的seq id no.7所示的上游引物c1和seq idno.8所示的下游引物c2及seq id no.9所示的探针c3；
8、用于检测禽白血病病毒alv-d亚群的seq id no.10所示的上游引物d1和seq idno.11所示的下游引物d2及seq id no.12所示的探针d3；
9、用于检测禽白血病病毒alv-e亚群的seq id no.13所示的上游引物e1和seq idno.14所示的下游引物e2及seq id no.15所示的探针e3；
10、用于检测禽白血病病毒alv-j亚群的seq id no.16所示的上游引物j1和seq idno.17所示的下游引物j2及seq id no.18所示的探针j3。
11、进一步，所述引物探针组还包括用于检测内标基因的seq id no.19所示的上游引物f1和seq id no.20所示的下游引物r1及seq id no.21所示的探针p1。
12、进一步，所述探针采用taqman探针，探针的5’端连接荧光报告基团，3’端连接猝灭基团。本专利技术提供的引物探针组能够在一批反应体系中，在两管中同时检测6种禽白血病病毒亚群。
13、在本专利技术具体的实施方式中，所述引物探针组分为引物探针a组和引物探针b组，引物探针a组包含用于检测禽白血病病毒alv-a、alv-d和alv-e亚群和用于检测内标基因的引物探针，四条探针的5’端分别连接不同的荧光报告基团，3’端连接不同的猝灭基团，引物探针b组包含用于检测禽白血病病毒alv-b、alv-c和alv-j亚群和用于检测内标基因的引物探针，四条探针的5’端分别连接不同的荧光报告基团，3’端连接不同的猝灭基团；在本专利技术优选的实施方式中，用于检测禽白血病病毒alv-a亚群的探针a3和用于检测禽白血病病毒alv-b亚群的探针b3的荧光报告基团选择fam荧光标记，猝灭基团选择mgb；用于检测禽白血病病毒alv-c亚群的探针c3和用于检测禽白血病病毒alv-d亚群的探针d3的荧光报告基团选择vic荧光标记，猝灭基团选择bhq1；用于检测禽白血病病毒alv-e亚群的探针e3和用于检测禽白血病病毒alv-j亚群的探针j3的荧光报告基团选择cy5荧光标记，猝灭基团选择bhq3；用于检测内标基因的探针p1的荧光报告基团选择rox荧光标记，猝灭基团选择bhq2，实现在两管中同时检测6种禽白血病病毒亚群，可以对待测样本中的禽白血病病毒进行快速分型检测，提早进行种鸡隔离，减少经济损失。
14、具体的，所述7条taqman探针的序列为：
15、用于检测禽白血病病毒alv-a亚群的taqman探针a3:
16、fam-cctcctctccttgtacactgg-mgb；
17、用于检测禽白血病病毒alv-b亚群的taqman探针b3:
18、fam-cacacatcctgacagatggaccaa-mgb；
19、用于检测禽白血病病毒alv-c亚群的taqman探针c3:
20、vic-ccacgtctccacagcggtaagt-bhq1；
21、用于检测禽白血病病毒alv-d亚群的taqman探针d3:
22、vic-cctgggccccatacgtcctca-bhq1；
23、用于检测禽白血病病毒alv-e亚群的taqman探针e3:
24、cy5-cacactgtttttcgggggatttgactg-bhq3；
25、用于检测禽白血病病毒alv-j亚本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种禽白血病病毒6个亚群的多重PCR检测的引物探针组，其特征在于，所述引物探针组包括：
2.根据权利要求1所述的引物探针组，其特征在于，所述引物探针组还包括用于检测内标基因的SEQ ID NO.19所示的上游引物F1和SEQ ID NO.20所示的下游引物R1及SEQ IDNO.21所示的探针P1。
3.根据权利要求2所述的引物探针组，其特征在于，所述探针采用TaqMan探针，探针的5’端连接荧光报告基团，3’端连接猝灭基团；优选的，所述引物探针组分为引物探针A组和引物探针B组，其中，引物探针A组包含用于检测禽白血病病毒ALV-A、ALV-D和ALV-E亚群和用于检测内标基因的引物探针，四条探针的5’端分别连接不同的荧光报告基团，3’端连接不同的猝灭基团；引物探针B组包含用于检测禽白血病病毒ALV-B、ALV-C和ALV-J亚群和用于检测内标基因的引物探针，四条探针的5’端分别连接不同的荧光报告基团，3’端连接不同的猝灭基团；更优选的，用于检测禽白血病病毒ALV-A亚群的探针A3和用于检测禽白血病病毒ALV-B亚群的探针B3的荧光报告基团选择FAM荧光
4.权利要求1-3任一所述引物探针组在制备检测禽白血病病毒ALV-A/B/C/D/E/J 6个亚群的试剂盒中的应用。
5.一种禽白血病病毒ALV-A/B/C/D/E/J 6个亚群的多重PCR检测的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求1-3任一所述引物探针组。
6.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括酶混合液、阳性对照和阴性对照；
7.权利要求1-3任一所述的引物探针组或权利要求5或6所述的试剂盒在同时检测禽白血病病毒ALV-A/B/C/D/E/J亚群上的应用。
8.一种同时检测禽白血病病毒ALV-A/B/C/D/E/J亚群的方法，其特征在于，包括如下步骤：
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述反应体系A中用于检测禽白血病病毒ALV-A亚群、禽白血病病毒ALV-D亚群以及禽白血病病毒内标的引物探针的终浓度均为200nmol/L，用于检测禽白血病病毒ALV-E亚群的引物探针的终浓度均为300nmol/L；所述反应体系B中用于检测禽白血病病毒ALV-B、ALV-C、ALV-J亚群和内标的引物探针的终浓度均为200nmol/L；
10.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述结果判读：
...【技术特征摘要】
1.一种禽白血病病毒6个亚群的多重pcr检测的引物探针组，其特征在于，所述引物探针组包括：
2.根据权利要求1所述的引物探针组，其特征在于，所述引物探针组还包括用于检测内标基因的seq id no.19所示的上游引物f1和seq id no.20所示的下游引物r1及seq idno.21所示的探针p1。
3.根据权利要求2所述的引物探针组，其特征在于，所述探针采用taqman探针，探针的5’端连接荧光报告基团，3’端连接猝灭基团；优选的，所述引物探针组分为引物探针a组和引物探针b组，其中，引物探针a组包含用于检测禽白血病病毒alv-a、alv-d和alv-e亚群和用于检测内标基因的引物探针，四条探针的5’端分别连接不同的荧光报告基团，3’端连接不同的猝灭基团；引物探针b组包含用于检测禽白血病病毒alv-b、alv-c和alv-j亚群和用于检测内标基因的引物探针，四条探针的5’端分别连接不同的荧光报告基团，3’端连接不同的猝灭基团；更优选的，用于检测禽白血病病毒alv-a亚群的探针a3和用于检测禽白血病病毒alv-b亚群的探针b3的荧光报告基团选择fam荧光标记，猝灭基团选择mgb；用于检测禽白血病病毒alv-c亚群的探针c3和用于检测禽白血病病毒alv-d亚群的探针d3的荧光报告基团选择vic荧光标记，猝灭基团选择bhq1；用于检测禽白血病病毒alv-e亚群的探针e3和用于检测禽白血病病毒alv-j亚群的探针j3...
【专利技术属性】
技术研发人员：张萍，王国兴，陈相永，熊倩倩，耿亮，辛文，
申请(专利权)人：北京脉道生物药品制造有限公司，
类型：发明
国别省市：
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