【技术实现步骤摘要】
本公开属于生物医药和疫苗，尤其涉及同时针对流感病毒ha蛋白和新冠病毒(sars-cov-2)s蛋白，具体为针对不同的流感病毒、禽流感病毒、新冠病毒的多联多价疫苗和组合物。
技术介绍
1、季节性流感是全球关注的重要公共卫生问题，可在高危人群中造成严重疾病和死亡。季节性流感病毒h1n1是一种甲型流感病毒，自1918年西班牙流感大流行后在人际间传播，与h3n2、乙型流感病毒两种季节性流感病毒交替流行，不断危害人类健康。与此同时，人感染不同型别的禽流感病毒的事件也持续发生，不仅对公众健康构成了巨大威胁，而且增加了发生大规模流行传播的风险。而且，流感与新冠合并感染会增加患者的重症和死亡风险。目前新型冠状病毒奥密克戎(omicron)变异株为全球流行的优势株，omicron变异株不断出现新的亚型，且携带更多的突变位点。与原始株和其他值得关切的变异株相比，omicron变异株致病性和毒性减弱，但免疫逃逸能力显著增加，传播速度更加迅速。
2、随着covid-19大流行的持续和季节性流感流行的周期性发生，疫苗是预防控制病毒传播的有效手段。由于季节性流感病毒、禽流感病毒和新冠病毒都具有高度的易变性和不确定性，所以相应的疫苗中包含的病毒必须定期进行更新，以使疫苗的免疫效果达到最佳。相比于传统疫苗，mrna疫苗研制周期短，能够快速更新迭代以针对个体化治疗。而联合型免疫策略为预防季节性流感和新冠不同变异株的感染、减少疫苗注射次数以及降低免疫不良反应提供了新思路。
技术实现思路
1、本专利技术提供
2、流感病毒颗粒呈球形，由外膜和包围于其中的核衣壳组成。外膜的外表面有两种糖蛋白突起：血凝素突起(haemagglutinin,ha)和神经氨酸酶突起(neuraminidase,na)。在流感病毒进入宿主细胞时，ha蛋白的功能是与细胞表面的唾液酸连接,使病毒粘连在宿主表面并随着内吞作用进入宿主体内，在低ph诱导下，最终实现由膜融合前状态(pre-fusion)到膜融合后状态(post-fusion)的转变，造成病毒与宿主细胞膜的融合。在完成新病毒繁殖后，na蛋白则负责将新病毒从宿主细胞释放，使病毒更易于粘附在宿主细胞膜上。
3、季节性流感病毒分为甲(a)、乙(b)、丙(c)三型，其中甲型流感ha和na容易发生突变，导致免疫原性改变，多次引起世界性大流行，因此分为多种亚型，目前甲型流感病毒ha可分为18个亚型，编号为h1～h18，na分为11个亚型，编号为n1～n11。乙型流感ha和na无亚型之分，目前主要包含yamagata系或victoria系。丙型流感病毒极少引起流行。
4、禽流感病毒为甲型流感病毒引起的人、禽类共患的急性传染病。由于禽流感病毒的血凝素结构等特点，其一般感染禽类，当病毒在复制过程中发生基因重配，致使结构发生改变，获得感染人的能力，才可能造成人感染禽流感疾病的发生。发现能直接感染人的禽流感病毒亚型有：h5n1、h7n1、h7n2、h7n3、h7n7、h9n2和h7n9亚型。
5、sars-cov-2与sars-cov和mers-cov同属于冠状病毒科的β-冠状病毒属。sars-cov-2基因组序列全长29903bp，与sars-cov基因序列同一性为79.5％，与mers-cov序列同一性为40％。sars-cov-2病毒颗粒的主要结构包括单股正链核酸(ssrna)、刺突蛋白(spikeprotein，s)、膜蛋白(membrane protein，m)、包膜蛋白(envelop protein，e)和核衣壳蛋白(nucelocapsid protein，n)。与其他β-冠状病毒类似，sars-cov-2病毒的对细胞的吸附入侵过程主要依赖于s蛋白；在该过程中，s蛋白以同源三聚体的形式装配，其具有短的胞质尾和疏水跨膜结构域，将蛋白质锚定到膜中。
6、s蛋白可分为受体结合亚基s1和膜融合亚基s2，s1亚基可进一步分成信号肽区域(signal peptide，sp)、n-端区域(n-terminal domain，ntd)和受体结合域(receptorbinding domain，rbd)。s2亚基通过跨膜区锚定在膜上，它含有膜融合过程所需要的基本元件，包括：内在的膜融合肽(fusion peptide，fp)、两个7肽重复序列(heptad repeat，hr)、跨膜结构域(transmembrane domain，tm)，以及c末端的胞质结构域(cytoplasmic domain，cp)。
7、s蛋白从n端到c端由信号肽区域(sp)、胞外结构域(ecd)、跨膜结构域(tm)和胞质结构域(cp)组成。其中，胞外结构域可进一步分成n-端区域(ntd)、受体结合域(rbd)、一个内在的膜融合肽(fp)和两个7肽重复序列(hr1和hr2)，属于第一类病毒膜融合蛋白。s蛋白的信号肽区域对应于s蛋白的氨基酸位置1-13的区域；胞外结构域对应于s蛋白的氨基酸位置14-1213的区域；跨膜结构域对应于s蛋白的氨基酸位置1214-1237的区域；胞质结构域对应于s蛋白的氨基酸位置1238-1273的区域。s蛋白的氨基酸序列如seq id no.1所示。在本文中，除非另有说明，否则重组s蛋白的氨基酸位置按照如seq id no.1所示的野生型s蛋白的氨基酸序列进行编号。
8、通过对s蛋白预融合结构进行解析，发现s1亚基的rbd结构域经历铰链类似的构象移动来隐藏或暴露受体结合的关键位点，“向下”为受体不可结合状态，“向上”为受体可结合状态，处于较为不稳定的状态。这种构象使得s蛋白能够容易地与宿主受体血管紧张素转换酶2(ace2)结合。当rbd与受体结合后，s2亚基通过将fp插入宿主细胞膜而改变为融合后构象，hr1和hr2形成一个反平行的六螺旋束(6hb)，共同组成一个融合核心，最终导致病毒膜与细胞膜融合。使用冷冻电镜实验，在预融合构象中确定了大量的三聚体s糖蛋白结构域，预融合s蛋白上存在大量中和抗体敏感表位，而融合后构象使仅存在于预融合构象上的中和敏感表位的暴露量降至最低。因此，表达预融合稳定形式的sars-cov-2s三聚体蛋白，是开发安全有效的sars-cov-2疫苗的关键。优化的疫苗抗原将保留存在于s蛋白的预融合构象形式中的表位，并诱导能够抑制病毒融合的抗体。
9、如本文所用的术语“新冠原始型病毒”、“新冠野生型病毒”、“sars-cov-2”可互换使用，并且是指2020年1月11日首次公布了病毒基因组序列的新冠病毒的原始株。新冠原始型病毒的s蛋白(也称为野生型s蛋白)的氨基酸序列如seq id no.1所示。新冠病毒在传播过程中不断变异，目前常见的变异株本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.免疫原性组合物，其包括一种或多种流感病毒株的血凝素蛋白(HA蛋白)或编码其的mRNA以及一种或多种新冠病毒株的刺突蛋白(S蛋白)或编码其的mRNA。
2.根据权利要求1所述的免疫原性组合物，其中所述一种或多种流感病毒株的HA蛋白选自甲型流感病毒HA蛋白、乙型流感病毒HA蛋白和禽流感病毒HA蛋白。
3.根据权利要求2所述的免疫原性组合物，其中所述一种或多种流感病毒株的HA蛋白选自以下(1)-(6)中的一种或多种，优选全部六种：
4.根据权利要求3所述的免疫原性组合物，其中所述一种或多种流感病毒株的HA蛋白选自氨基酸序列如SEQ ID NO.2-7中的一种或多种，优选全部六种所示的HA蛋白。
5.根据权利要求1-4中任一项所述的免疫原性组合物，其中所述一种或多种新冠病毒株的S蛋白选自以下(1)-(4)中的一种或多种，优选全部四种：
6.根据权利要求5所述的免疫原性组合物，其中所述一种或多种新冠病毒株的S蛋白相对于野生型S蛋白在胞外结构域中包括以下突变：
7.根据权利要求6所述的免疫原性组合物，其中所述S1/S
8.根据权利要求7所述的免疫原性组合物，其中所述一种或多种新冠病毒株的S蛋白选自氨基酸序列如SEQ ID NO.8-11中的一种或多种，优选全部四种所示的S蛋白。
9.根据权利要求1所述的免疫原性组合物，其包括选自以下(1)-(6)的全部六种的HA蛋白：
10.根据权利要求9所述的免疫原性组合物，其包括氨基酸序列如SEQ ID NO.2-7所示的HA蛋白和氨基酸序列如SEQ ID NO.8-11所示的S蛋白。
11.根据权利要求1-10中任一项所述的免疫原性组合物，其中所述mRNA从5’到3’方向包含帽结构、5’-UTR、开放阅读框(ORF)、3’-UTR和polyA尾。
12.根据权利要求11所述的免疫原性组合物，其中所述5’-UTR包含衍生自17β-羟基类固醇脱氢酶4(HSD17B4)基因的5’-UTR或其同源物、片段或变体，优选地，所述5’-UTR包含如SEQ ID NO.32所示的序列；
13.根据权利要求1-12中任一项所述的免疫原性组合物，其中编码所述一种或多种流感病毒株的HA蛋白的mRNA选自SEQ ID NO.12-17中的一种或多种，优选全部六种。
14.根据权利要求1-13中任一项所述的免疫原性组合物，其中编码所述一种或多种新冠病毒株的S蛋白的mRNA选自SEQ ID NO.18-21中的一种或多种，优选全部四种。
15.根据权利要求1-14中任一项所述的免疫原性组合物，其中所述mRNA中的一个或多个尿苷三磷酸各自独立替换为假尿苷三磷酸、2-硫尿苷三磷酸、5-甲基尿苷三磷酸、N1-甲基假尿苷三磷酸或5-乙炔基尿苷三磷酸，和/或一个或多个胞苷三磷酸替换为5-甲基胞苷三磷酸，和/或一个或多个腺苷三磷酸替换为N6-甲基腺苷三磷酸；优选地，所述mRNA中的一个或多个尿苷三磷酸各自独立替换为假尿苷三磷酸、1-甲基-假尿苷三磷酸或5-乙炔基尿苷三磷酸，和/或一个或多个胞苷三磷酸替换为5-甲基胞苷三磷酸。
16.根据权利要求1-15中任一项所述的免疫原性组合物，其中所述mRNA包封在载体材料中。
17.根据权利要求16所述的免疫原性组合物，其中所述载体材料选自脂质纳米颗粒(LNP)、鱼精蛋白、高分子材料和无机纳米颗粒。
18.根据权利要求1所述的免疫原性组合物，其包括编码选自以下(1)-(6)的全部六种的HA蛋白的mRNA：
19.根据权利要求18所述的免疫原性组合物，其包括核苷酸序列如SEQ ID NO.12-17所示的编码HA蛋白的mRNA和核苷酸序列如SEQ ID NO.18-21所示的编码S蛋白的mRNA。
20.根据权利要求1-19中任一项所述的免疫原性组合物，其中所述组合物中每种蛋白或mRNA的摩尔浓度不超过其他任一种蛋白质或mRNA的摩尔浓度的3倍，优选地，每种蛋白质或mRNA的摩尔浓度基本相同。
21.根据权利要求20所述的免疫原性组合物，其中所述组合物包括选自以下(1)-(6)的全部六种的HA蛋白或编码其的mRNA：
22.根据权利要求20所述的免疫原性组合物，其中所述组合物中每种蛋白或mRNA的摩尔比例为1:1:1:1:1:1:1:1:1:1。
23.根据权利要求1-22中任一项所述的免疫原性组合物，其中所述组合物还包含佐剂。
24.根据权利要求23所述的免疫...
【技术特征摘要】
1.免疫原性组合物，其包括一种或多种流感病毒株的血凝素蛋白(ha蛋白)或编码其的mrna以及一种或多种新冠病毒株的刺突蛋白(s蛋白)或编码其的mrna。
2.根据权利要求1所述的免疫原性组合物，其中所述一种或多种流感病毒株的ha蛋白选自甲型流感病毒ha蛋白、乙型流感病毒ha蛋白和禽流感病毒ha蛋白。
3.根据权利要求2所述的免疫原性组合物，其中所述一种或多种流感病毒株的ha蛋白选自以下(1)-(6)中的一种或多种，优选全部六种：
4.根据权利要求3所述的免疫原性组合物，其中所述一种或多种流感病毒株的ha蛋白选自氨基酸序列如seq id no.2-7中的一种或多种，优选全部六种所示的ha蛋白。
5.根据权利要求1-4中任一项所述的免疫原性组合物，其中所述一种或多种新冠病毒株的s蛋白选自以下(1)-(4)中的一种或多种，优选全部四种：
6.根据权利要求5所述的免疫原性组合物，其中所述一种或多种新冠病毒株的s蛋白相对于野生型s蛋白在胞外结构域中包括以下突变：
7.根据权利要求6所述的免疫原性组合物，其中所述s1/s2切割位点突变为ggsg，和/或所述s2切割位点突变为an。
8.根据权利要求7所述的免疫原性组合物，其中所述一种或多种新冠病毒株的s蛋白选自氨基酸序列如seq id no.8-11中的一种或多种，优选全部四种所示的s蛋白。
9.根据权利要求1所述的免疫原性组合物，其包括选自以下(1)-(6)的全部六种的ha蛋白：
10.根据权利要求9所述的免疫原性组合物，其包括氨基酸序列如seq id no.2-7所示的ha蛋白和氨基酸序列如seq id no.8-11所示的s蛋白。
11.根据权利要求1-10中任一项所述的免疫原性组合物，其中所述mrna从5’到3’方向包含帽结构、5’-utr、开放阅读框(orf)、3’-utr和polya尾。
12.根据权利要求11所述的免疫原性组合物，其中所述5’-utr包含衍生自17β-羟基类固醇脱氢酶4(hsd17b4)基因的5’-utr或其同源物、片段或变体，优选地，所述5’-utr包含如seq id no.32所示的序列；
13.根据权利要求1-12中任一项所述的免疫原性组合物，其中编码所述一种或多种流感病毒株的ha蛋白的mrna选自seq id no.12-17中的一种或多种，优选全部六种。
14.根据权利要求1-13中任一项所述的免疫原性组合物，其中编码所述一种或多种新冠病毒株的s蛋白的mrna选自seq id no.18-21中的一种或...
【专利技术属性】
技术研发人员：张必良，程楠，马林，李曼，钟惠玲，杨子峰，马钦海，王洋，潘蔚绮，
申请(专利权)人：阿格纳生物制药有限公司，
类型：发明
国别省市：
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