一种抑制PCSK9靶基因表达的核酸序列及其应用制造技术

本发明专利技术涉及一种抑制PCSK9基因表达的siRNA，其正义链核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，反义链核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，且发现上述正、反义链核苷酸序列分别经取代、缺失和/或添加1～6个碱基而形成的新的核苷酸序列经退火生成的siRNA采用多种化学修饰方法进行结构改造后，对基因PCSK9的表达都具有很好的抑制活性。通过对上述siRNA进行配体修饰，形成新的缀合物，在保持了较高的抑制活性和稳定性的同时，还具有较好的肝靶向性和促进细胞内吞的能力，并且其还具有优异的亲和力，为未来靶向治疗提供了可能。向治疗提供了可能。

【技术实现步骤摘要】
一种抑制PCSK9靶基因表达的核酸序列及其应用


[0001]本专利技术涉及分子生物学领域，特别是涉及一种抑制PCSK9靶基因表达的核酸序列及其应用。

技术介绍

[0002]前蛋白转化酶枯草溶菌素9(Proprotein convertase subtilisin/kexin type 9,PCSK9)是属于Ca
2+
依赖的丝氨酸内切酶，PCSK9可以通过细胞外及细胞内途径与低密度脂蛋白受体(low density lipoprotein receptor，LDLR)结合，促进LDLR的降解；细胞外途径也是发挥作用的主要方式，分泌至细胞外的PCSK9通过与细胞膜上的LDLR结合，使得LDLR被内吞形成内体，最终进入溶酶体而被降解；在细胞内途径中从高尔基体分泌出的PCSK9进入细胞质，直接与LDLR结合，使LDLR在细胞内直接进入溶酶体降解途径。由于LDLR是组织尤其是肝脏摄取循环中胆固醇的重要方式，因此PCSK9的含量增加引起的LDLR降解会导致循环中胆固醇含量的升高，这使得PCSK9成为降低血胆固醇的重要靶点。
[0003]并且，低密度脂蛋白胆固醇(LDL
‑
C)升高是心血管疾病主要的危险因素，PCSK9抑制剂具有强大的降低LDL
‑
C作用，是极具前景的新型降脂药物。靶向PCSK9的siRNA药物从mRNA层面上阻断PCSK9蛋白功能，降低血液中的LDL
‑
C水平，比传统药物具有特异性好、易于设计、低毒性、不产生耐药性等特点。
[0004]siRNA作为一种新的治疗方法具有巨大的发展潜力，siRNA作用于细胞内的mRNA,相对于传统的小分子药物，它能够直接沉默靶基因，因此可以从根本上更高效地组织疾病的发生和发展，但由于siRNA稳定性较差，在体内容易被核酸酶降解，不易被组织吸收，难以被细胞摄取，易产生脱靶效应等缺陷，使得其在临床应用上受到局限。对siRNA进行恰当的修饰能够增加siRNA的稳定性，同时有效抑制目的基因的表达。

技术实现思路

[0005]基于此，本专利技术的目的之一在于提供一种抑制或降低PCSK9靶基因表达的siRNA。
[0006]包括如下技术方案：
[0007]一种抑制或降低PCSK9靶基因表达的siRNA，其由互补的正义链和反义链组成；所述正义链的碱基组成序列选自SEQ ID NO.1
‑
SEQ ID NO.2，并且，所述正义链从5
′
末端起第1个碱基和从3
′
末端起第1
‑
2个连续碱基均进行2
′‑
O
‑
甲基修饰；所述反义链的碱基组成序列选自SEQ ID NO.3
‑
SEQ ID NO.9。
[0008]本专利技术的目的之一还在于提供一种药物组合物。
[0009]包括如下技术方案：
[0010]一种药物组合物，其有效成分包括上述抑制或降低PCSK9靶基因表达的siRNA。
[0011]本专利技术的目的之一还在于提供上述药物组合物在预防或缓解或治疗由PCSK9靶基因表达引起的疾病中的应用。
[0012]本专利技术的目的之一还在于提供一种抑制或降低PCSK9靶基因表达的方法。
[0013]包括如下技术方案：
[0014]一种抑制或降低PCSK9靶基因表达的方法，其为引入上述抑制或降低PCSK9靶基因表达的siRNA、和/或上述药物组合物。
[0015]本专利技术的专利技术人基于对PCSK9和siRNA技术的深入研究，在正义链碱基组成序列为SEQ ID NO.1，反义链碱基组成序列为SEQ ID NO.3，或正、反义链核苷酸序列分别经取代、缺失和/或添加多个碱基并经修饰而形成的siRNA中，找到了一种siRNA，其正义链碱基组成序列为SEQ ID NO.1，反义链碱基组成序列为SEQ ID NO.8，同时，发现对siRNA的核糖环进行2
′‑
O
‑
甲基、2
′‑
氟代修饰，还能在保持抑制目的基因表达能力的前提下，能够减少其被血液和组织中核酸酶降解，增加体内的稳定性，提高其做为临床药物的适用性。特别是对上述碱基序列中的部分碱基进行特定的化学组合修饰(即正义链从5
′
末端到3
′
末端的方向，第1、2、6位碱基为2
′‑
O
‑
甲基修饰，第4、8、10位碱基为2
′‑
氟代修饰，倒数第1、2、5、6、8位碱基为2
′‑
O
‑
甲基修饰，倒数第3、4、7位碱基为2
′‑
氟代修饰；反义链仅采用2
′‑
氟代修饰，特别是从5
′
末端到3
′
末端的方向，第1、4、5、7、8、10、12、13、14、16、17、20、21、22、24位碱基为2
′‑
氟代修饰)，形成的siRNA：RB
‑
51在使用浓度低至6nM时就能够有效降低PCSK9靶基因表达。
[0016]对siRNA：RB
‑
51进一步进行配体修饰，在形成的缀合物(GalNac
‑
siRNA)：RB59
‑
RB71中，经内吞实验和亲和力实验发现，RB
‑
61、RB
‑
70可以在有效降低PCSK9靶基因表达的同时，还具有良好的促进细胞内吞的能力，并且还具有优异的亲和力，预示其在临床使用中，可降低对其他组织或器官的影响以及减少siRNA分子的使用量，从而达到减轻毒性和降低成本的目的；还可以更有效地进入细胞或组织发挥作用，有望开发为降脂药物并为靶向治疗提供了可能。
附图说明
[0017]图1为实施例1中不同siRNA对PCSK9 mRNA表达水平影响的统计结果。
[0018]图2为实施例2中半乳糖修饰单体L的合成反应流程图。
[0019]图3为实施例3中采用Hela细胞进行内吞实验，不同siRNA对PCSK9mRNA表达水平影响的统计结果。
[0020]图4为实施例3中采用原代小鼠肝细胞进行内吞实验，不同缀合物对PCSK9mRNA表达水平影响的统计结果。
[0021]图5为实施例3中采用原代小鼠肝细胞进行内吞实验，不同缀合物下活细胞群Cy5荧光的平均荧光强度MFI统计结果。
具体实施方式
[0022]为了便于理解本专利技术，下面将参照实施例对本专利技术进行更全面的描述，以下给出了本专利技术的较佳实施例。但是，本专利技术可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。提供这些实施例的目的是使对本专利技术的公开内容的理解更加透彻全面。应理解，下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。实施例中所用到的各种常用试剂，均为市售产品。
[0023]除非另有定义，本本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种抑制或降低PCSK9靶基因表达的siRNA，其特征在于，所述siRNA由互补的正义链和反义链组成；所述正义链的碱基组成序列选自SEQ ID NO.1
‑
SEQ ID NO.2，并且，所述正义链从5
′
末端起第1个碱基和从3
′
末端起第1
‑
2个连续碱基均进行2
′‑
O
‑
甲基修饰；所述反义链的碱基组成序列选自SEQ ID NO.3
‑
SEQ ID NO.9。2.根据权利要求1所述抑制或降低PCSK9靶基因表达的siRNA，其特征在于，所述正义链从5
′
末端到3
′
末端的方向，第1
‑
7位碱基为2
′‑
O
‑
甲基修饰，倒数第1
‑
7位碱基位2
′‑
O
‑
甲基修饰；或，第1、6位碱基为2
′‑
O
‑
甲基修饰，倒数第1、2、5、6位碱基为2
′‑
O
‑
甲基修饰，第4、8位碱基为2
′‑
氟代修饰。3.根据权利要求1所述抑制或降低PCSK9靶基因表达的siRNA，其特征在于，所述反义链从5
′
末端到3
′
末端的方向，第2位碱基为2
′‑
O
‑
甲基修饰；或，第3、4、7、8位碱基为脱氧核糖核苷酸修饰；或，第9、11、13、14、15、17、18位碱基为2
′‑
氟代修饰。4.根据权利要求1
‑
3任一项所述抑制或降低PCSK9靶基因表达的siRNA，其特征在于，所述正义链的碱基组成序列为SEQ ID NO.1，并且所述正义链从5
′
末端到3
′
末端的方向，第1、2、6位碱基为2
′‑
O
‑
甲基修饰，第4、8、10位碱基为2
′‑
氟代修饰，倒数第1、2、5、6、8位碱基为2
′‑
O
‑
甲基修饰，倒数第3、4、7位碱基为2
′‑
氟代修饰；所述反义链的碱基组成序列为SEQ ID NO.8，并且所述反义链从5
′
末端到3
′
末端的方向，第1、4、5、7、8、10、12、13、14、16、17、20、21、22、24位碱基为2
′‑
氟代修饰。5.根据权利要求1
‑
4任一项所述抑制或降低PCSK9靶基因表达的siRNA，其特征在于，所述抑制或降低PCSK9靶基因表达的siRNA经过配体修饰，所述配体修饰为siRNA与配体化合物连接而成，所述配体化合物的结构为Ax
‑
lin...

【专利技术属性】
技术研发人员：张必良，李曼，
申请(专利权)人：阿格纳生物制药有限公司，
类型：发明
国别省市：