【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于基因工程和生物，具体涉及一种油菜磷脂酶d基因(bnpldζ2基因)在调控油菜叶片衰老和磷回收中的用途。
技术介绍
1、磷是植物生长发育所必需的大量营养元素之一，是细胞内各种生物大分子(蛋白质、核酸等)和各类代谢物(磷脂、三磷酸腺苷等)的重要组成成分，其在细胞内能量转化和细胞信号转导等众多生理生化过程中发挥着重要作用。农业生产过程中需大量施用磷肥来保障农作物的产量，但作物产量的提升往往伴随着磷肥的过量使用，导致大量磷元素流入江河湖泊中，最终出现水体富磷化等诸多环境问题。
2、叶片是植物最大的营养器官之一，叶片在衰老过程中会将细胞中的各种营养元素如碳、氮、磷和钾等回收转移到新的组织中，进而促进植物的生长以及提高产量。衰老叶片中最高有90％的磷转运到新组织中回收再利用，目前对于磷素回收的研究主要集中在核酸磷，而提高衰老叶片中脂质磷的回收再利用效率是实现作物磷高效利用的有效途径。
3、磷脂酶d(phospholipase d，简称pld，能水解膜磷脂形成最为简单的磷脂酸和亲水的头部基团，水解靠近磷脂头部基团的磷酸二脂酯键水解，可应用于食品的磷脂改性、高质量磷脂的制备等，随着磷脂酶d在细胞信号传递、细胞骨架组装、膜运输及降解、细胞防御反应等过程中作用的日渐明确，目前已通过各种转基因手段将其应用于植物的抗旱、耐盐、抗病育种中。现已证明pld是一个多基因家族，不同基因之间有功能差异，其蛋白质序列具有高度保守性，且已发现植物中的pldα、pldβ、pldγ等，它们由不同的基因编码，且在植物生长发育和各种不同
技术实现思路
1、本专利技术的目的是提供bnpldζ2基因在调控油菜叶片衰老和磷回收中的用途。
2、申请人从油菜中克隆了bnpldζ2基因。研究表明，bnpldζ2基因主要在衰老叶片中表达，且其表达受黑暗胁迫诱导。当敲除bnpldζ2后，油菜生长受阻，油菜叶片衰老显著推迟，磷元素回收减慢。而超表达bnpldζ2可以促进油菜的生长和叶片的衰老，通过脂质组分析，发现超表达植株叶片中甘油磷脂水平显著低于野生型。bnpldζ2的表达水平升高会加速细胞内磷脂的代谢，致使甘油磷脂中磷素的加速释放，从而提高了细胞中无机磷的含量，促进了植物的生长。同时，bnpldζ2转录水平的提升，会引起一系列脂代谢基因、磷代谢基因和衰老调节基因表达的上调，它们共同促进了磷脂中磷素的释放和油菜叶片的衰老来加速叶片的生长。这些结果表明，bnpldζ2基因可以调控油菜叶片的衰老过程以及磷的回收。
3、本专利技术涉及的bnpldζ2基因编码一种磷脂酶d，该基因在油菜a1染色体上有一个拷贝bnaa01.pldζ2，编码该基因的核苷酸序列如序列表seq id no:1所示，由3144bp组成；该基因编码的蛋白质序列如seq id no:2所示，编码1047个氨基酸。
4、本专利技术的另一个目的在于提供一种促进油菜叶片衰老和磷回收的方法，该方法包括以下步骤：使用农杆菌介导的遗传转化方法将含有所述bnpldζ2基因的超表达载体转化到油菜的基因组中，获得bnpldζ2基因超表达的油菜品种。
5、具体步骤如下：
6、(1)提取油菜rna并反转录成cdna；
7、(2)以上述cdna为模板，设计pcr引物扩增bnpldζ2基因；
8、(3)将扩增产物酶切连接到pmdc83载体并转化感受态细胞，构建植物超表达载体；
9、(4)将所述植物超表达载体导入农杆菌，对油菜进行遗传转化，获得bnpldζ2基因超表达的油菜品种。
10、本专利技术还利用crispr cas9基因编辑技术获得bnpldζ2基因突变体，使用农杆菌介导的遗传转化方法将该突变体转化到油菜的基因组中，获得基因bnpldζ2基因功能缺失的油菜品种。
11、本专利技术通过获得过表达和突变体材料，分析了转化植株的生长状况和叶片衰老情况，发现bnpldζ2基因的超表达显著提高了油菜叶片的衰老过程，促进了叶片中磷元素的快速回收。
12、本专利技术中所述的表达载体是指现有技术中已知的、能够在植物中进行表达的任何载体，例如适用于构建本专利技术所述的表达载体包括但不限于，pmdc83(华中农业大学洪月云课题组提供)、pkse401(中国农业大学陈其军课题组提供)等。
13、本专利技术首次发现bnpldζ2基因调控油菜叶片衰老和磷回收的功能，利用该基因获得的油菜品种不仅可促进油菜生长提高产量，而且有利于减少磷肥的使用，避免出现水体富磷化，在产业中具有很好的应用价值。
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1.BnPLDζ2基因在调控油菜叶片衰老和磷回收中的用途，所述BnNPC4基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，该基因编码蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。
2.一种促进油菜叶片衰老和磷回收的方法，其特征在于：使用农杆菌介导的遗传转化方法将含有权利要求1中所述BnPLDζ2基因的超表达载体转化到油菜的基因组中，获得BnPLDζ2基因超表达的油菜品种。
【技术特征摘要】
1.bnpldζ2基因在调控油菜叶片衰老和磷回收中的用途，所述bnnpc4基因的核苷酸序列如seq id no:1所示，该基因编码蛋白的氨基酸序列如seq id no:2所示。
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