一种改进的培养海藻的方法技术

本发明专利技术提供一种改进的培养海藻的方法，包括培育一种快速生长的变种，该变种克服了在聚乙烯袋中产量降低的不足，并且得到的生物量与在无袋的开放培养基中生长得到的生物量相近。而且，从组织培养发育的植株中得到的半提纯角叉菜胶产量和质量与对照亲本植株相似。还提供了通过着色愈伤组织细胞进行体细胞胚胎发生大规模克隆繁殖小无性芽的方法。（*该技术在2020年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种改进的藻类培养方法，本专利技术涉及大型植物多细胞海藻(seaweed)领域，尤其是海上养殖海藻。G.C.Trono，(Seaweed Cultivation and Marine Ranching，M.Ohno和A.T.Critchley，(eds.)，JICA Publication，Japan，75-88，1993)已经讲述了麒麟菜和Kappaphycus的分类与培养，并说明栽培者确实在野外的农田环境下进行了初选，即从收获中筛选出最优等的植物作为原材料来种植下一季作物。培养这种菌株最主要的缺点是由于它缺乏对农田环境下季节变化的适应性导致的产量不稳定。C.J Dawes和E.W.Koch(J.Appl.Phycology，3，247-257，1991)以及C.J.Dawes，G..C.Trono和A.0.Lluisma(Hydrobiologia，260/261，379-383，1993)尝试通过微量繁殖和组织培养找到一种合适的方法来维持和繁殖所选择出的麒麟菜各种培育品种克隆，他们的研究重点在于建立合适的实验室培养技术，通过微小的植物碎片来克隆繁殖种植的麒麟菜。这种使用小插条的繁殖主要缺点是后代只具备亲本的特征，而在目的特征的表达上并没有明显优于亲本。D.P.Cheney，Wang和Le Zhong在美国专利No.5,585,544，1996中公开了一种使耳突麒麟菜和刺麒麟菜体细胞杂交的方法，通过在营养液中培养两个非常相近种的海藻体细胞，然后分离出具有更可取终产物特征的杂交体细胞苗。这种藻类体细胞杂交的主要不足在于目前该方法只能使后代从亲本中继承已有的特性而不能导入新的特性。已有几篇关于商业种植和培养Kappaphycus和麒麟菜的文章发表(J.R.Lim和J.Porse.Proc.of the Intl.Seaweed Symp.10，601-606，1981；H.Adnan和H.Porse，Hydrobiologia，151/152，355-358，1987；R.Azanza-Corrales and P.Sa-a，Hydrobiologia，204/205，521-525，1990；G.P.B.Samonte，A.Q.Hurtado-ponce and R.Caturao，Aquaculture，110，1-11，1993)。G.C.Trono(Seaweed Cultivation and Marine Ranching，M.Ohno和A.T.Critchley(eds.)，JICA Publication，Japan，75-88，1993)，其中公开了两种类型培养方法，例如固定离底单线方法和漂浮筏或长线方法，该方法已在全球范围内被接受为麒麟菜的培养方法，在这两种方法中，挑选出的带有丰富分枝的麒麟菜尖端插条(5-100g)以25-30cm的间隔使用软塑料材料系在培养绳上使其生长(在菲律宾被称为节-节方法)，等生长到一千克或更多时收获海藻。根据其生长率每60-90天收获一次作物。不论单线方法还是流动阀或长线方法都存在几个局限和不足，分别是(i)无性芽/种子物质被食草动物所食，这些食草动物可能吃掉全部的材料，这样就影响了后续的作物收成，(ii)由于植物未加保护，它们可能因为恶劣的海洋条件从培养绳上被冲走，(iii)在恶劣海洋环境生长过程中，附生植物和外来颗粒的沉积需要累赘又费时的清洗工作以确保终产物的质量。O.P.Mairh等人(Indian J.Marine Sciences，24，24-31，1995)成功的表明养殖场条件下在实验规模袋装培养异枝麒麟菜的可行性。但是，该方法的主要不足在于，与在没有聚乙烯袋子的开放性水环境中生长相比，该方法的日生长率有所降低。本专利技术克服了在袋子中生长微弱的不足，通过对传统的海藻进行体外组织培养技术，开发出了一种快速生长的菌株，该菌株在袋中展现出与亲本植物在开放的水环境中差不多相同的生长潜力。专利技术目的本专利技术的主要目的是提供一种改进的培养藻类的方法，尤其是麒麟菜，该方法克服了上述的不足。本专利技术的另一目的是通过组织培养形成一种麒麟菜快速生长品种。本专利技术还提供一种方法，该方法使克隆生产大量繁殖体(幼苗材料)用于大规模培养重要的海藻成为可能。图2是外植体分离出的麒麟菜愈伤组织再次培养中旺盛的生长。图3显示分离出的愈伤组织上球形或椭圆形微小无性芽。图4是本专利技术培养快速生长菌株方法的一个具体实施方案中所述由微小无性芽生长得到的幼无性芽。图5是从无性芽传代得到的麒麟菜多分枝幼胚。图6是本专利技术生产大量种子方法的一个实施方案中所述愈伤组织体细胞胚胎在体外的发育。图7是改进的培养方法一个实施例中聚乙烯袋中的麒麟菜漂浮长线培养体系。图8显示对照亲本植株和组织培养得到的海藻生长比较。专利技术详述相应的，本专利技术提供一种培养海藻的组织培养方法，所述方法包括以下步骤a)建立用于组织培养的无污染可生长海藻材料，依次用带有家用液体去污剂，聚乙烯吡咯酮碘(povidine iodine)的无菌海水处理海藻材料，最后在含有广谱抗生素混合物和杀真菌剂的Provasoli浓缩海水培养基(PES)中温育处理过的材料24到96个小时，然后用无菌海水彻底清洗，去除痕量的抗生素和杀真菌剂，再与无菌滤纸印记，得到无菌的外植体；b)在温度20-25℃，20-50μmol光量子m-2s-1辐射量的冷白荧光下和12∶12黑白循环，PES加强的琼脂板上培养无菌的外植体，诱导愈伤组织；c)至少40天后，从外植体分离出愈伤组织，在40-60μmole光量子m-2s-1辐射量的冷白荧光和12∶12黑白循环下在新鲜琼脂板上传代培养愈伤组织，得到分化的深着色的椭圆形或球形小无性芽；d)在PES培养基琼脂板中在40-60μmole光量子m-2s-1辐射量的冷白荧光和12∶12黑白循环下，传代培养着色愈伤组织薄片约20-40天，使得着色丝状愈伤组织中的体细胞胚胎发生和小无性芽的形成都得到了提高；e)将带有体细胞胚胎的丝状愈伤组织转入液体PES培养基在振动条件下培养，使其进行形态发生并从无性芽发展成带有多枝的幼胚；以及f)在封装的穿孔聚乙烯袋中培养幼胚，大规模培养海藻。在一个实施方案中，所用外植体是从海藻上部取下的长1-6mm，直径3-4mm的插条。在另一实施方案中，海藻用1-5％含青霉素，链霉素硫酸盐，卡那霉素，制霉菌素和新霉素在100ml蒸馏水中的抗生素混合物的PES培养基处理。在另一实施方案中，无菌的外植体在20-25℃，20-30μmole光量子m-2s-1辐射量的冷白荧光和12∶12黑白循环下，在PES加强的含有0.8-3％琼脂的琼脂板中培养。在另一实施方案中，通过培养在20-25℃，20-50μmole光量子m-2s-1辐射量的冷白荧光和12∶12黑白循环下，在PES培养基制成的且以包埋培养物形式存在于含有0.3-0.6％琼脂的琼脂板中的着色愈伤组织的薄片，传代培养愈伤组织，在每个包埋块上得到丰富分枝的丝状着色愈伤组织。在一个实施方案中，所用植物生长调节因子选自0.1-1.0mg/l萘乙酸和0.1mg l-1萘乙酸和6-苄氨基嘌呤。在另一实施方案中，无菌的外植体是在琼脂板上培养约40-45天。在另一实施本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种培养海藻的组织培养方法，该方法包括步骤： ａ）通过下述步骤建立组织培养所用无菌的可生长海藻材料：依次用含有家用液体去污剂和含有聚乙烯吡咯酮碘（ｐｏｖｉｄｉｎｅ ｉｏｄｉｎｅ）的无菌海水处理海藻材料，最后在含有广谱抗生素混合物和杀真菌素的Ｐｒｏｖａｓｏｌｉ浓缩海水（ＰＥＳ）培养基中培育２４到９６小时，再用无菌海水彻底清洗，去除痕量的抗生素和杀真菌素，再与无菌的滤纸印记，得到无菌的外植体； ｂ）在ＰＥＳ培养基增强的琼脂板上培养无菌外植体，温度范围为２０－２５℃，在２０－５０μｍｏｌ光量子ｍ↑［－２］ｓ↑［－１］辐射量的冷白荧光下，１２∶１２黑白循环，诱导愈伤组织； ｃ）至少４０天后，从外植体上分割出愈伤组织，在４０－６０μｍｏｌ光量子ｍ↑［－２］ｓ↑［－１］辐射量的冷白荧光下，１２∶１２黑白循环，在新鲜琼脂板上传代培养愈伤组织，得到分化的深着色椭圆形或球形小无性芽； ｄ）在４０－６０μｍｏｌ光量子ｍ↑［－２］ｓ↑［－１］辐射量的冷白荧光下，１２∶１２黑白循环，在含有植物生长调节剂的ＰＥＳ培养基制成的琼脂板上传代培养深着色愈伤组织薄片约２０到４０天，在着色丝状愈伤组织中得到增多的体细胞胚胎发生和小无性芽形成； ｅ）将带有体细胞胚胎的丝状愈伤组织转移至液体ＰＥＳ培养基，振荡条件下培养，使其进行形态发生以及从无性芽发育成带有多枝的幼苗；和 ｆ）通过在封装的带孔聚乙烯袋中培养幼苗大规模培养海藻生物量。...

【技术特征摘要】
1.一种培养海藻的组织培养方法，该方法包括步骤a)通过下述步骤建立组织培养所用无菌的可生长海藻材料依次用含有家用液体去污剂和含有聚乙烯吡咯酮碘(povidine iodine)的无菌海水处理海藻材料，最后在含有广谱抗生素混合物和杀真菌素的Provasoli浓缩海水(PES)培养基中培育24到96小时，再用无菌海水彻底清洗，去除痕量的抗生素和杀真菌素，再与无菌的滤纸印记，得到无菌的外植体；b)在PES培养基增强的琼脂板上培养无菌外植体，温度范围为20-25℃，在20-50μmol光量子m-2s-1辐射量的冷白荧光下，12∶12黑白循环，诱导愈伤组织；c)至少40天后，从外植体上分割出愈伤组织，在40-60μmol光量子m-2s-1辐射量的冷白荧光下，12∶12黑白循环，在新鲜琼脂板上传代培养愈伤组织，得到分化的深着色椭圆形或球形小无性芽；d)在40-60μmol光量子m-2s-1辐射量的冷白荧光下，12∶12黑白循环，在含有植物生长调节剂的PES培养基制成的琼脂板上传代培养深着色愈伤组织薄片约20到40天，在着色丝状愈伤组织中得到增多的体细胞胚胎发生和小无性芽形成；e)将带有体细胞胚胎的丝状愈伤组织转移至液体PES培养基，振荡条件下培养，使其进行形态发生以及从无性芽发育成带有多枝的幼苗；和f)通过在封装的带孔聚乙烯袋中培养幼苗大规模培养海藻生物量。2.权利要求1的方法，其中组织培养所用材料选自海洋红藻和褐藻，包括麒麟菜属、杉藻属、角叉菜属、海带属、裙带菜属、昆布属、羽叶藻属、巨藻属、马尾藻属和喇叭藻属。3.权利要求1的方法，其中组织培养所用材料选自异枝麒麟菜、Kappaphycus alvarezzi、耳突麒麟菜、E.denticulatum、刺麒麟菜、E.alvarazii、E.procrusteanum、小杉藻、G.exasparata和皱波角叉菜。4.权利要求1的方法，其中所用外植体包含取自海藻顶部、且直径为3-4mm，长度为1-6mm的插条。5.权利要求1的方法，其中海藻材料首先用0.1-1％家用液体去污剂处理5-20分钟，接着用0.1-2％聚乙烯吡咯酮碘处理2-7分钟，最后在含有1-5％抗生素混合物的provasoli浓缩海水中处理04-96...

【专利技术属性】
技术研发人员：CR瑞蒂，OP梅瑞，GR库玛，K埃斯娃安，PV苏巴瑞奥，KH穆蒂，PK戈施，
申请(专利权)人：科学与工业研究委员会，
类型：发明
国别省市：IN[印度]