【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物医药领域，涉及一种以氨基酸突变方式改造优化多肽分子获得新型自抗原，并将其作为i型糖尿病疫苗开发基础的方案，具体涉及一种基于自抗原多肽分子的i型糖尿病疫苗。
技术介绍
1、i型糖尿病是一种由自主激活cd4+和cd8+淋巴细胞导致的自免疫疾病。虽然直接激活cd4+t细胞免疫反应的相关抗原一直无法确定，但一众潜在自体产生抗原(自抗原)已被广泛报道，其中包括但不限于gad65、hsp、znt8、pdx1、胰岛素和部分自免疫疾病相关新生抗原。胰岛素和其它相关多肽分子早已作为潜在的自抗原被用于主动且可控的cd4+t细胞免疫反应激活，从而实现疫苗的效用。然而，胰岛素和多个相关多肽分子在激活cd4+t细胞免疫反应的实验中呈现复杂的结果。hla-dq8作为i型糖尿病患者样本中过表达的人类白细胞抗原(human leukocyte antigen，hla)基因，研究人员发现自抗原多肽分子与其具有复杂的结合构象和状态，导致无法准确测定相关结合亲和力。由于hla-多肽分子-t细胞受体(t cell receptor，tcr)三元复合物的成功形成是激活cd4+t细胞免疫反应的重要先决条件，复杂的hla-多肽分子结合构象将严重影响自抗原多肽分子激活cd4+t细胞免疫反应效果的评定。
2、i型糖尿病的病因复杂，目前尚未完全理解，同时缺乏清晰的相关免疫分子激活机制，导致i型糖尿病疫苗的研发收效甚微。此外，i型糖尿病患者人群多样，疾病进展和发展轨迹各不相同，这使得疫苗研发难以统一标准，并导致疫苗效果的变化难以预测。现有的i型糖尿病疫
技术实现思路
1、针对上述
技术介绍
存在的缺陷，本专利技术提供一种基于自抗原多肽分子的i型糖尿病疫苗。本专利技术在优化设计自抗原多肽分子的过程中可以准确描述和测定单点或多点突变引起的整体结合构象差异；提供一种计算机模拟的、相较实验更为省时省力的hla-多肽分子-tcr三元复合物结合亲和力计算方法，在现有自抗原的基础上进行大量氨基酸突变模拟实验，是获得有效引发自免疫反应的自抗原多肽分子的新途径。
2、本专利技术采用以下技术方案：
3、本专利技术基于一种从i型糖尿病患者获得的i型糖尿病自抗原序列(carqedtamvyyfdyw)，通过计算机模拟大量单点、双点以及交换式氨基酸突变，快速并准确测量自抗原与相关免疫分子的结合亲和力，筛选相较于已知i型糖尿病自抗原具有更高hla-dq8和tcr结合亲和力的自抗原多肽分子，选择靠前的若干自抗原序列进行通过分析羧基荧光素乙酰乙酸(cfse)示踪t细胞增殖实验，挑选经实验验证后可有效引发i型糖尿病相关cd4+t淋巴细胞增殖的自抗原多肽分子，即为具免疫原性的自抗原。获得的自抗原将以人工合成多肽分子的形式作为i型糖尿病疫苗的开发基础。
4、所述具免疫原性的自抗原作为i型糖尿病疫苗的有效成分，其呈现形式为：一个或多个具免疫原性自抗原多肽分子，或一个或多个具免疫原性自抗原肽段的多肽链，或一个或多个具免疫原性自抗原肽段氨基酸序列的多聚核苷酸。以所述具免疫原性的自抗原作为有效成分即可制得i型糖尿病疫苗，所述i型糖尿病疫苗可与其他i型糖尿病药物联合使用。
5、所述氨基酸突变涉及自抗原的4、5、6、7号位点。氨基酸突变的目标为缬氨酸(val，v)、酪氨酸(tyr，y)、异白氨酸(ile，i)、蛋氨酸(met，m)、半胱氨酸(cys，c)、谷氨酰胺(gln，q)。
6、本专利技术设计得到的自抗原包括以下氨基酸序列：carqedtamyvyfdyw、carqedtamvvvfdyw、carqedtamvcyfdyw、carqedtamvrrfdyw。
7、所述i型糖尿病自抗原序列的选取和来源与i型糖尿病患者是否正在接受i型糖尿病相关治疗无关。其获取方法具体为：首先对i型糖尿病患者至少部分基因进行测序；然后将i型糖尿病患者和正常人进行基因比对，即可获得所述i型糖尿病自抗原序列。
8、上述筛选相较于i型糖尿病自抗原序列具有更高hla-dq8和tcr结合亲和力的自抗原多肽分子，具体方法如下：
9、1.构建hla-多肽分子-tcr三元复合物、hla-多肽分子二元复合物、多肽分子的全原子三维结构。
10、2.通过分子动力学模拟hla-多肽分子-tcr三元复合物、hla-多肽分子二元复合物、多肽分子的动态状态。
11、3.结构表征hla-多肽分子-tcr三元复合物、hla-多肽分子二元复合物、多肽分子的动态构象变化。
12、4.定义免疫分子复合物体系的“结合态”和“非结合态”。
13、5.通过自由能微扰方法，在“结合态”的基础上将多肽分子上指定位点的原始氨基酸突变为目标氨基酸，同时计算该过程中获得或消耗的系统自由能。
14、6.通过自由能微扰方法，在“非结合态”的基础上将多肽分子上指定位点的原始氨基酸突变为目标氨基酸，同时计算该过程中获得或消耗的系统自由能。
15、7.将基于“结合态”获得的自由能差减去基于“非结合态”获得的自由能差得到该多肽分子对hla的结合亲和力，以及自抗原序列的多肽分子和hla分子形成的hla-多肽分子二元复合物对tcr的结合亲和力。
16、8.筛选出与hla和tcr分子结合亲和力较高的候选多肽分子。
17、本专利技术有益效果如下：
18、本专利技术成功筛选出针对hla-dq8和i型糖尿病相关tcr具更高结合亲和力的自抗原多肽分子，并通过基于cfse的t细胞增殖实验证实其可以更有效地激活cd4+t细胞引发免疫反应，适合以人工合成自抗原多肽分子的形式作为i型糖尿病疫苗的开发基础。
19、本专利技术在优化设计自抗原多肽分子的过程中可以准确描述和测定单点或多点突变引起的整体结合构象差异；提供一种计算机模拟的、相较实验更为省时省力的hla-多肽分子-tcr三元复合物结合亲和力计算方法，在现有自抗原的基础上进行大量氨基酸突变模拟实验，是获得有效引发自免疫反应的自抗原多肽分子的新途径。
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1.一种基于自抗原多肽分子的I型糖尿病疫苗，所述I型糖尿病疫苗的有效成分为：一系列具免疫原性的自抗原，其特征是：所述自抗原是对I型糖尿病自抗原序列进行氨基酸突变得到的，所述I型糖尿病自抗原序列为CARQEDTAMVYYFDYW，所述氨基酸突变涉及自抗原的4、5、6、7号位点，突变的目标为缬氨酸V、酪氨酸Y、异白氨酸I、蛋氨酸M、半胱氨酸C和谷氨酰胺Q。
2.根据权利要求1所述的一种基于自抗原多肽分子的I型糖尿病疫苗，其特征是：所述具免疫原性的自抗原为：一个或多个具免疫原性自抗原多肽分子，或一个或多个具免疫原性自抗原肽段的多肽链，或一个或多个具免疫原性自抗原肽段氨基酸序列的多聚核苷酸。
3.根据权利要求1所述的一种基于自抗原多肽分子的I型糖尿病疫苗，其特征是：所述自抗原序列具体为：CARQEDTAMYVYFDYW、CARQEDTAMVVVFDYW、CARQEDTAMVCYFDYW、CARQEDTAMVRRFDYW中的一种或任意几种。
4.根据权利要求1所述的一种基于自抗原多肽分子的I型糖尿病疫苗，其特征是：所述疫苗可与其他I型糖尿病药物联合使用。
...【技术特征摘要】
1.一种基于自抗原多肽分子的i型糖尿病疫苗，所述i型糖尿病疫苗的有效成分为：一系列具免疫原性的自抗原，其特征是：所述自抗原是对i型糖尿病自抗原序列进行氨基酸突变得到的，所述i型糖尿病自抗原序列为carqedtamvyyfdyw，所述氨基酸突变涉及自抗原的4、5、6、7号位点，突变的目标为缬氨酸v、酪氨酸y、异白氨酸i、蛋氨酸m、半胱氨酸c和谷氨酰胺q。
2.根据权利要求1所述的一种基于自抗原多肽分子的i型糖尿病疫苗，其特征是：所述具免疫原性的自抗原为：一个或多个具免疫原性自抗原多肽...
【专利技术属性】
技术研发人员：周如鸿，宋伊，陈骏，
申请(专利权)人：上海浙江大学高等研究院，
类型：发明
国别省市：
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